Оптимизированная количественная оценка стабильности энхансерной РНК в эмбриональных стволовых клетках мышей
November 21st, 2025
Этот протокол количественно измеряет стабильность и период полураспада интергенных и интрагенных энхансерных РНК в эмбриональных стволовых клетках мышей с помощью терапии актиномицином D, RT-qPCR и нелинейного регрессионного анализа. Стратегии нормализации, специфичные для позиции, применяются для точного моделирования динамики распада eRNA в контекстно-зависимом виде.
Наша лаборатория изучает эпигенетику, сосредотачиваясь на модификации РНК и энхансерах на молекулярном уровне. Недавно мы обнаружили, что фермент РНК m5C Nsun2 регулируется внутригенным энхансером в эмбриональных стволовых клетках мышей. Для начала предварительно покройте колодцы шестиколодной клеточной культивной пластины двумя миллилитрами желатина на каждую скважину.
Инкубировать тарелки при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Аспирируйте желатин из каждой колодцы, затем промыйте каждую лунку одним миллилитром PBS. Стерилизуйте тарелки, подвергая их ультрафиолетовому свету минимум на 15 минут.
Семена мыши помещают эмбриональные стволовые клетки на желатино-покрытые пластины, используя два миллилитра полного клеточного культурного материала на каждую скважину. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в увлажнённом инкубаторе с 5% углекислого газа. Далее растворите актиномицин D в диметилсульфоксиде, чтобы получить стандартный раствор с концентрацией один миллиграмм на миллилитр.
Через два дня после посева клеток или в день сбора урожая добавьте раствор актиномицина D в культурную среду. Сбор образцов через 0, 5, 10, 15, 20 и 30 минут после обработки. После транскрипционной остановки экспрессия энхансерных РНК быстро снижалась в течение пяти минут, тогда как мессенджерные РНК снижались более постепенно и оставались относительно стабильными в течение 30 минут. Анализ периодов полураспада показал, что энхансерные РНК имеют период полураспада примерно две-три минуты, тогда как мессенджерные РНК — значительно более длинный — более 60 минут.
Для интергенной энхансерной РНК Pou5f1 нормализация в РНК мессенджера TBP или до порога цикла при нулевой минуте дала аналогичные оценки времени полураспада. Данные секвенирования зарождающихся РНК показали повышенные значения RPKM в области энхансера Nsun2 по сравнению с отрицательным контролем. RT-qPCR-анализ подтвердил более высокую нормализованную экспрессию Nsun2 двух интергенных энхансеров РНК в области энхансера Nsun2 по сравнению с отрицательной контрольной группой.
Метод нормализации, используемый для интергенных энхансеров, уместен, поскольку паттерн экспрессии относительно отрицательного контроля соответствует паттерну, наблюдаемому при использовании RPKM. Наше исследование предлагает метод измерения и нормализации короткой полулинии быстро разлагающихся усилителей. Мы рассматриваем отсутствие чёткого метода для сравнения межгенной и интрагенной активности энхансеров.
Он упрощает обработку данных и позволяет быстро рассчитывать затухание mESC с помощью чётких, точных шагов.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол количественно измеряет стабильность и период полураспада интергенных и интрагенных усиливающих РНК в эмбриональных стволовых клетках мыши с использованием лечения актиномицином D, RT-qPCR и нелинейного регрессионного анализа. Используются стратегии нормализации, специфические для позиции, чтобы точно моделировать динамику распада eRNA в зависимости от контекста.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Эпигенетика
- Модификация РНК
- Биология усилителей
Фон
- Усиливающие РНК (eRNA) играют важную роль в регуляции генов.
- Фермент РНК m5C Nsun2 регулируется интрагенными усилителями.
- Эмбриональные стволовые клетки мыши служат моделью для изучения функции усилителей.
- Понимание стабильности eRNA важно для выяснения механизмов экспрессии генов.
Цель исследования
- Измерить стабильность и период полураспада eRNA в эмбриональных стволовых клетках мыши.
- Использовать лечение актиномицином D для оценки распада РНК.
- Применять нелинейный регрессионный анализ для моделирования динамики eRNA.
Используемые методы
- Лечение актиномицином D для ингибирования транскрипции.
- RT-qPCR для количественного определения уровней eRNA.
- Нелинейный регрессионный анализ для моделирования распада.
- Стратегии нормализации, специфические для позиции, для получения точных результатов.
Основные результаты
- Получены количественные измерения стабильности eRNA.
- Определены периоды полураспада интергенных и интрагенных eRNA.
- Успешно моделировались контекстно-зависимые динамики распада.
- Результаты способствуют пониманию регуляции усилителей в стволовых клетках.
Выводы
- Протокол предоставляет надежный метод для изучения стабильности eRNA.
- Результаты подчеркивают важность регуляции усилителей в экспрессии генов.
- Будущие исследования могут опираться на эти результаты для изучения функций eRNA.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of enhancer RNA (eRNA) stability in mouse embryonic stem cells addresses a critical gap in understanding transcriptional regulation dynamics during early discovery. Accurate measurement of eRNA decay kinetics enables mechanistic de-risking and informs target validation strategies for gene regulatory elements. This capability supports predictive confidence in modulating enhancer activity for therapeutic discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of enhancer function and regulatory pathway dynamics in pluripotent systems.
- Supports biological de-risking by quantifying rapid turnover of non-coding regulatory RNAs.
- Facilitates functional target validation for enhancer-associated gene expression control.
- Provides quantitative data to inform predictive confidence and portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated workflows for measuring RNA stability in high-turnover systems.
- Standardizes normalization and decay modeling for reproducible quantitative outputs.
- Prepares robust assay platforms for screening enhancer modulators or RNA stability regulators.
- Enables reliable evaluation of compound effects on enhancer RNA dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models where enhancer dysregulation impacts gene expression.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of regulatory RNA targets.
- Provides mechanistic insights for risk-adjusted advancement of enhancer-targeted programs.
- Strengthens predictive de-risking for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative eRNA stability method integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, supporting both hypothesis testing and downstream assay development.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of enhancer function and RNA turnover in stem cell models.
- Screening: Provides standardized, reproducible decay measurements for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative half-life and decay curve outputs for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects enhancer RNA dynamics to disease-relevant gene regulation when supported by model context.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable framework for regulatory RNA stability assessment across diverse targets and systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in enhancer target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible RNA stability measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying enhancer function early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regulatory RNA targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biology, quantitative PCR, and decay modeling analytics.
- Needs access to cell culture, transcriptional inhibition reagents, and RT-qPCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization of normalization and data analysis protocols.
- Adaptable to other cell types or enhancer contexts with appropriate validation.
- Short half-life of eRNAs necessitates precise timing and rapid sample processing.
