Эпигенетическая инженерия клеток K562: двухвекторная эписомальная стратегия для стабильного целевого метилирования ДНК с использованием гибридных белков dCas9-DNMT3A и -HDAC1

Наши исследования направлены на создание стабильной, неинтегрированной системы таргетированной метилирования ДНК, исследуя устойчивое эпигенетическое редактирование в клетках K562. Недавние достижения в этой области включают системы двойного эффектора CRISPR-dCas9, объединяющие эпигенетические ферменты для синергетичной, стабильной и локально специфической эпигенетической модификации. Для начала поддерживайте клетки K562 в колбах T75 при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа и увлажнённых условиях.

Количественно определить эпизомальную ДНК, используемую для трансфекции, с помощью спектрофотометра диаметром 260 нанометров. Используйте восемь микрограммов общей ДНК плазмиды на каждую трансфекцию, подготовив по четыре микрограмма каждой плазмиды для ко-трансфекции, и смешайте необходимое количество с 90 микролитрами ультрачистой воды. Теперь добавьте 10 микролитров 3 раствора ацетата натрия моляра и 2,5 объёма 100% этанола в разбавленный раствор ДНК.

Тщательно перемешайте раствор ДНК и инкубуйте его ночью при 20 градусах Цельсия, чтобы обеспечить осаждение ДНК. На следующий день центрифугуйте ДНК-пробирку при 11 000 G в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. В стерильных условиях в шкафу с биобезопасностью аккуратно сбрасываете супернатант из трубки.

Добавьте в трубку 500 микролитров этанола 70% для промывки гранулы и снова центрифугуйте при 11 000 G в течение пяти минут при 4 градусах Цельсия. Далее полностью удалите этаноловый супернатант из пробирки и дайте ДНК-грануле высохнуть на воздухе, пока не останется видимый этанол. Затем тщательно суспензуйте засохшую ДНК-гранулу в 50 микролитрах DMEM.

Храните 400 нанограммов повторно суспензированной ДНК примерно 2,5 микролитра в новой пробирке, а раствор плазмидного DMEM храните при 4 градусах Цельсия до дальнейшего использования. Оставшийся образец ДНК проведёт на геле 1%агарозы для проверки очистки и целостности ДНК. Берите клетки K562 из колбы T75, когда культуры достигают 50–60% совпадения, чтобы обеспечить оптимальную эффективность трансфекции.

Подсчитайте собранные клетки с помощью гемоцитометра и перенесите объём, состоящий от двух умноженных на 10 на мощность пяти клеток, в 35-миллиметровую культурную чашу с 900 микролитрами DMEM без FBS и антибиотиков. Поместите контейнер в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа, чтобы клетки оставались готовыми к трансфекции. Используйте комплект для трансфекции на основе липофектамина для подачи плазмид, следуя инструкциям производителя и при необходимости регулируя объёмы.

Добавьте три микролитра реагента P3000 в ранее подготовленный раствор плазмидного DMEM. Аккуратно перемешайте и инкубуйте смесь при комнатной температуре в течение пяти минут. Теперь добавьте пять микролитров реагента Липофектамина 3000 вместе с достаточным количеством DMEM, чтобы получить итоговый объём в 100 микролитров.

Инкубировать эту смесь для трансфекции при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте полные 100 микролитров смеси трансфекции в 35-миллиметровую культурную чашу, содержащую клетки. Аккуратно встряхните блюдо, чтобы смесь равномерно распределилась, затем верните её в инкубатор.

Через 24 часа после трансфекции добавьте три миллилитра полноценного среднего DMEM с добавлением 10% FBS и один раз пенициллин-стрептомицина в каждую чашку, чтобы стимулировать пролиферацию трансфективных клеток. Через 72 часа после трансфекции начните отбор, добавив антибиотик G418, чтобы достичь конечной концентрации один миллиграмм на миллилитр. Когда процесс отбора будет установлен и общее количество клеток превысит один умножить на 10 при степени шести, забирайте клетки центрифугой при 300 G в течение шести минут при 25 градусах Цельсия.

Промыйте гранулу один раз с одноразовым стерильным PBS, pH примерно 7,4, и снова центрифугуйте при тех же условиях. После повторного суспензия конечной клеточной гранулы в однократном PBS определите концентрацию клетки с помощью гемоцитометра. Разведите суспензию до 10 раз до мощности шесть элементов на миллилитр, чтобы клетки полностью повторно взвешены, и перенесите клетки в проточную цитометрическую трубку.

Далее настройте сортировщик клеток, активируемый флуоресценцией, в режим одной клетки, используя 96-колодную пластину, обработанную тканевыми культурами, в качестве устройства для сбора информации. Регулируйте настройки программного обеспечения в зависимости от используемого инструмента. Откройте первичную популяцию, выбирая ячейки на основе прямого и бокового рассеяния для выделения ожидаемого размера и детализации.

Исключайте мусор и высокогранулированные или мёртвые ячейки и используйте графики прямого рассеяния по высоте или площади бокового рассеяния против высоты для блокировки элементов. Затем заранее заполните каждую яме пластины на 96 лунок 100 микролитрами полной среды, содержащей один миллиграмм на миллилитр G418, и нагрейте пластину в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. Выполняйте сортировку ячеек в режиме отдельных ячеек, поддерживая частоту сортировки ниже 300 событий в секунду для повышения точности.

После сортировки осмотрите каждую скважину под микроскопом, чтобы подтвердить наличие одной ячейки в каждой скважине, и поместите пластину в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Позвольте клонам с одной клеточкой расширяться по отдельности в 96-ядровой пластине. Когда появляется заметный клональный рост, в скважины добавьте среду с восстановленным G418 до конечной концентрации 400 микрограмм на миллилитр для поддержания давления отбора.

Переносите хорошо растущие клоны последовательно на пластины с 12 ямецами, затем на колбы T25 и, наконец, на колбы T75 по мере необходимости, пока каждый клон не достигнет примерно одного умножения на 10 при мощности шести ячеек. Далее собирайте двойные клеточные гранулы с регулярными интервалами. Храните одну гранулу при минус 20 градусах Цельсия для извлечения геномной ДНК.

Гомогенизировать вторую гранулу в 500 микролитрах реагента TRIzol и хранить при минус 20 градусах Цельсия для экстракции РНК и комплементарного синтеза ДНК. Извлекать геномную ДНК из выбранных клонов с помощью экстракции фенол-хлороформа, а затем этанола. Полностью суспензировать извлеченную ДНК в воде без нуклеазы или в буфере TE.

Измерьте концентрацию и чистоту ДНК с помощью спектрофотометра, прежде чем продолжить работу по следующим этапам. Наконец, извлекайте полную РНК из хранящихся клеточных гранул с помощью реагента TRIzol, после чего следует осаждение изопропанола. Отдельные клетки были отсортированы на пластины с 96 лунками с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток для выделения тех, что несут обе конструкции.

ПЦР-анализ 10 расширенных клонов подтвердил, что лишь некоторые сохранили оба конструкта, что подтверждается полосами на 230 парах оснований и 205 парах оснований. Пиросеквенирование показало, что положительный клон два показал повышенную метилирование на нескольких участках CPG рядом с целевой областью gRNA1 по сравнению с нетрансфектированным контролем. Мы решаем недостаток неинтегрированных долгосрочных систем доставки, позволяющих точное и стабильное эпигенетическое редактирование без изменения генома хозяина.

Наши результаты создают надёжный инструмент для изучения регуляции генов посредством целевого метилирования и поддерживают разработку возможных точных эпигенетических методов терапии. Будущие исследования будут посвящены улучшению эписомальной доставки, минимизации целевых эффектов, повышению эффективности Cas9 и адаптации системы для первичных и in vivo моделей.