Локализация плазматической мембраны и внутриклеточных нейронных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов с помощью количественной визуализации в клетках млекопитающих

Понимание трафика никотиновых ацетилхолиновых рецепторов в плазматические мембраны млекопитающих имеет решающее значение для изучения регуляции, опосредованной шаперонами, и оценки целенаправленной селективной терапии. Основным преимуществом чувствительных к pH зондов в сочетании с конфокальной микроскопией живых клеток является высокое пространственное разрешение расположения субъединиц. Для начала разогрейте реагенты до 37 градусов Цельсия.

Полностью разморозить субъединицу nAChR DNase и довести реагент для трансфекции до комнатной температуры. Очистите все реагенты 70% этанолом перед тем, как поместить их в шкаф для биобезопасности. Для экспрессии альфа-7 nAChR в микроцентрифугной трубке разведите плазмидную ДНКазу альфа-7 и NACHO в восстановленную сывороточную среду.

Аккуратно перемешивайте, пипетируя после добавления ДНК. Альтернативно, чтобы экспрессировать рецепторы альфа-4 бета-2, разведите по 4 микрограмма каждой субъединицы ДНК до общего объема 250 микролитров восстановленной сывороточной среды и аккуратно перемешайте. Скорректируйте соотношение субъединиц для оптимизации экспрессии определённых изоформ рецепторов.

Для альфа-4-бета-2-рецепторов с дополнительной плазмидой добавляйте равное количество ДНК каждой плазмиды. Далее, в новой микроцентрифуге разведите 8 микролитров реагента для трансфекции по капле до 250 микролитров восстановленной сывороточной среды. После 5-минутной инкубации при комнатной температуре соедините разбавленный ДНКазу с разбавленной трансфекционной реагентом по капле в трубку.

Аккуратно перемешайте пипеткой и инкубуйте 20 минут при комнатной температуре. Пока образуются комплексы, замените среду в культурных чашках на 1 миллилитр EMEM без сыворотки. Добавьте 500 микролитров комплекса реагентов для трансфекции ДНК по каплям в каждую чашу.

Аккуратно перемешивайте, раскачивая пластину, чтобы равномерно распределить, особенно по стеклянной нижней поверхности. Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов, а через 4-6 часов заменить среду. Удалите старую среду с помощью всасывания.

Ополосните блюдо три раза двумя миллилитрами PBS в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 2 миллилитра буфера pH 7.4 в антенну. Вставьте антенну для визуализации в держатель затвора конфокального микроскопа и поместите её в предварительно нагретую камеру окружающей среды.

Подключите трубку перистальтического насоса к держателю для съёмочной антенны и закройте камеру окружающей среды. Теперь запустите программное обеспечение для визуализации и выберите лазеры для интересующих флюорофоров. Просканируйте антенну, чтобы найти клетки для изображения, используя объектив размером 10-60 x.

Увеличьте увеличение при желании и регулируйте глубину фокусировки по мере необходимости. Выберите предпочтительное разрешение и захватите одно изображение с использованием нужной цели. Запишите местоположение на карте антенны, чтобы переместить те же ячейки после смены буфера.

Повторяйте съёмку для нескольких областей антенны, используя одинаковые настройки захвата для всех изображений. Держа только выходную трубу подключённой к перистальтическому насосу, медленно отсасывайте буфер pH 7.4 из антенны в контейнер для отходов. Затем переключите впускную линию в буфер закалки pH 5.5.

Включите перистальтический насос, чтобы добавить буфер pH 5,5 при расходе 1,5 миллилитра в минуту, обеспечивая сохранение соединения ячеек. Через 20 минут выключите насос и инкубируете клетки в буфере ещё 20 минут для уравновесия. После инкубации повторяйте сохранённые локации.

Чтобы начать количественную оценку изображения, откройте ImageJ и загрузите изображение для анализа. Изображение будет выглядеть как стек, при этом каждый захваченный канал отображается в одном кадре. Перейти к фазовому каналу.

Если изображение кажется слишком ярким, выберите «Процесс» и «Улучшить контраст», затем нажмите «ОК». Используйте инструмент увеличения, чтобы увеличить одну ячейку. Используйте инструмент свободного выбора, чтобы обвести контур ячейки в фазовом канале. Затем переключитесь на люминесцентный канал, соответствующий интересующему флуорофору.

Задайте нужные измерения, выбрав Анализ и нажав на Set Measurements. Убедитесь, что проверяются площадь, среднее серое значение и интегрированная плотность. Чтобы измерить выбранный регион, выберите «Анализировать» и нажмите «Измерить».

Проведите три фоновых измерения, обведя пустые участки рядом с выбранной ячейкой. После проведения измерений для всех нужных ячеек скопируйте и вставьте данные измерения в Excel для анализа. Затем вычислите среднее значение по трём измерениям.

Вычислите скорректированное общее флуоресцентное значение ячейки или CTCF для каждой ячейки по предоставленной формуле. Используя тот же рабочий процесс, анализируйте изображения, полученные после смены буфера. Экспортировать все результаты в программное обеспечение для анализа данных для статистической обработки.

Слабое окрашивание альфа-BTX AF647 наблюдалось в нетрансфектированных N2a-клетках, а в клетках, трансфектированных альфа-7 ДНК, — устойчивое маркирование пунктата. Количественная оценка подтвердила, что экспрессия альфа-7 nAChR в плазматической мембране была значительно выше в клетках с альфа-7 трансфекцией N2a, чем в нетрансфектированных контролях. При pH 7,4 общая флуоресценция альфа-7 pHuji была видна на плазматической мембране.

в трансфектированных клетках N2a. При pH 5,5 флуоресценция альфа-7 pHuji была снижена, что выявило локализацию внутренних рецепторов. Наружная флуоресценция альфа-7 pHuji рецепторов обеспечивала основную экспрессию рецепторов.

Количественная оценка показала, что 82,6% рецепторов альфа-7 pHuji находились на плазматической мембране, а 17,4% — внутренними. Флуоресценция была восстановлена при возвращении к pH 7,4, что подтвердило обратимость сигнала pHuji. При pH 7,4 клетки N2a, экспрессирующие альфа-4 SEP и бета-2 pHuji, показали устойчивую мембранную флуоресценцию для обеих субъединиц.

При pH 5,5 флуоресценция была подавлена, что указывает на внутреннюю локализацию некоторых субъединиц альфа-4 SEP и бета-2 pHuji. Количественная оценка показала, что 76,5% альфа-4 SEP находилось на плазматической мембране, а 23,4% — внутреннее. В тройных трансфекционных клетках альфа-4 SEP демонстрировал локализацию мембраны 82,8% и внутреннюю экспрессию 17,2%.

В тех же клетках 63,4% субъединиц бета-2 pHuji были локализованы на мембране, а 36,6% — внутриклеточно. Используя представленный протокол, мы охарактеризовали новые эффекты шаперонов на экспрессию и трафик никотиновых рецепторов, а также оценили новые целенаправленные селективные терапии. Преимущество нашего протокола — адаптивность для гомомерных и гетеромерных никотиновых рецепторов, что позволяет количественно определить относительное расположение клеток.

Наш подход обеспечивает быструю, устойчивую экспрессию плазматических мембран никотиновых рецепторов, способствуя анализу трафика с помощью шаперонов и усилиям по поиску лекарств.