Создание модели на основе органоидов простаты мыши для изучения взаимодействий хозяина и патогена

Это исследование сосредоточено на понимании того, как бактериальные патогены инфицируют эпителий предстательной железы и какие взаимодействия с патогенами хозяина определяют исход инфекции. Существование моделей in vitro плохо отражало разнообразие эпителий простаты. Эта модель обеспечивает физиологически значимую систему, отражающую различия типов клеток в ткани.

Для начала получите трёхмерные органоиды мышиной простаты, культивируемые на каплях внеклеточного матрикса в пластине с 24 лунками. Аспирируйте среду из нужного количества скважин и добавьте в каждую скважину 500 микролитров свежей культурной среды. Использование пипетки P 1000 механически нарушает падение внеклеточной матрицы в каждой яме.

Соберите эту суспензию в 15-миллилитровую коническую трубку, в которой не более двух колодцев в каждой трубе. Добавьте свежую культурную среду, чтобы увеличить объём до 10 миллилитров. Аккуратно переверните трубку три-четыре раза, чтобы перемешать и центрифугировать при 450 G в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия.

Аспирировать супернатант. Заново суспензуйте гранулу в двух миллилитрах ферментного раствора, предварительно разогрейте до 37 градусов Цельсия и инкубуйте суспензию в водяной бане при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут. С помощью пипетки P 1000 смешивайте суспензию клетки каждые пять минут во время инкубации.

После инкубации добавьте свежую культурную среду, чтобы получить итоговый объём 10 миллилитров. Аккуратно переверните трубку три-четыре раза, чтобы смешать. Центрифугу при 450 G в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия.

Аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу. Повторная суспензия гранулы в 300 микролитрах культурной среды с добавлением 10 микромолярных ингибиторов породы. С помощью камеры счёта Нойбауэра подсчитайте клетки в подвешенности.

Разбавить суспензию до концентрации 62 500 клеток на миллилитр в культурной среде с добавлением 10 микромолярных породных ингибиторов. Затем засейте по 200 микролитров суспензии на каждую скважину для пластины на 48 лунок и 300 микролитров на скважину для камерных микрозатворов. Инкубировать пластины в инкубаторе для клеточной культуры при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Через один день проверьте, прикреплены ли большинство отдельных клеток к поверхности двумерной культуры. Заменяйте культурную среду каждые два-три дня и продолжайте сеялизацию до достижения слияния в течение семи дней. Для индуцирования дифференцировки с целью обогащения люминальных клеток добавьте 10 наномоляров пяти альфа-дигидротестостерона или ДГТ к суспензии клетки во время посева.

Нанесите уропатогенный штамм Escherichia coli, или UPEC, на пластину LB агара с добавлением 100 микрограммов на миллилитр ампициллина. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в течение 16–24 часов. Используя стерильную петлю инокуляцию: три миллилитра бульона LB, дополненные 100 микрограммами на миллилитр, ампициллином с одной бактериальной колонией.

Инкубировать культуру статически при 37 градусах Цельсия в течение 12–16 часов. Вихрь — ночную бактериальную культуру. Измерьте оптическую плотность культуры на 600 нанометрах.

Затем рассчитайте объём культуры, необходимый для достижения начальной оптической плотности 0,05 в трёх миллилитрах бульона. Добавьте рассчитанный объём бактериальной культуры в свежий бульон LB, дополненный ампициллином. Инкубировать статически при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов.

После инкубации завихрьте бактериальную культуру. Измерьте оптическую плотность на 600 нанометров. Рассчитайте объём культуры, необходимый для достижения оптической плотности единицы.

Центрифугуйте необходимый объём при 12 000 G в течение двух минут при комнатной температуре. Аспирируйте и отвергайте супернатант. Повторно суспензировать бактериальную гранулу в одном миллилитре примуса и свободной органоидной культурной среде без ДГТ.

Затем разведите суспензию органоидной культурой простаты мышей, чтобы получить множительность инфекции 100. Аспирируйте культурную среду из подготовленной органоидной модели. Добавьте 200 микролитров культурной среды с бактериями в каждую яме пластины на 48 лунок.

Инкубировать в течение часа в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. Аспирируйте бактерии, содержащие среду из колодцев, и трижды промывайте колодцы свежей культурной средой для удаления внеклеточных бактерий. Затем добавьте культурную среду с 50 микрограммами на миллилитр гентамицина и инкубуйте 30 минут.

Аспирируйте среду. Добавьте свежую культурную среду, дополненную 10 микрограммами на миллилитр гентамицина на оставшееся время заражения. Используйте конфокальный микроскоп для изображения заражённых клеток после флуоресцентного окрашивания и количественной оценки инфицированных клеток с помощью потокового цитометра.

В контрольном состоянии без дигидротестостерона большинство клеток имели цитокератин, пять положительных базальных клеток, при этом лишь некоторые демонстрировали низкую экспрессию люминального уровня CD 24 8. Дополнение одним наномолярным ДГТ дало смешанные базальные люминальные популяции, хотя CD 24 A оставался низким. Увеличение ДГТ до 10 наномоляров способствовало дифференцировке в люминальные клетки, при этом некоторые базальные клетки сохранялись после семи дней культуры.

Это коррелировало с количественными исследованиями, показывающими снижение количества цитокератин, пять положительных базальных клеток, и увеличение числа положительных люминальных клеток CD 24A с увеличением концентрации ДГТ со временем. Через ноль часов после заражения UPEC в большом количестве прилипал к эпителиальным клеткам. После часа обработки гентамицином количество UPEC-положительных клеток резко сократилось.

Через 24 часа количество заражённых клеток было примерно таким же, как в один час. Конфокальная визуализация через 24 часа показала, что внутриклеточные бактерии продолжают размножаться, формируя кластеры, похожие на сообщество. Этот протокол позволяет исследователям изучать динамику бактериальных инфекций и взаимодействия патогенов в модели, сохраняющей разнообразие эпителиальных клеток.

Будущие исследования могут использовать эту модель для изучения различных заболеваний простаты, включая инфекции, биологию рака, а также для тестирования потенциальных терапевтических соединений.