Вычислительный конвейер для количественного определения межгенной/внутригенной энхансерной РНК в эмбриональных стволовых клетках мыши

Наша группа изучает энхансерную эпигенетику и эпитранскриптомику, сосредотачиваясь на разработке точного метода количественного определения энхансерных РНК как индикаторов активации энхансеров. Поскольку интрагенные энхансеры находились с транскриптами хозяина, различать сигналы энхансера DER и количественно их оценивать сложно. Для начала откройте терминал и введите команду для подготовки необходимых файлов и ссылок для идентификации усилителя.

Введите команду в терминале для входа в рабочий каталог. Затем запустите команду, которая копирует скрипты идентификации энхансера в текущий каталог. Затем выполните соответствующую команду для генерации BED-файлов для областей промоторов, тел генов и генов, кодирующих белки, с помощью аннотации кода гена.

Подготовить файлы ATAC-seq и Histone ChIP-seq для идентификации энхансера. Введите соответствующую команду предварительной обработки в терминале. Далее выполните команду для определения и классификации усилителей с использованием пиков хроматина.

Введите команду для назначения временной информации о цепи в межгенный усилитель BED. Далее введите команду, чтобы определить правильное направление цепи для интергенных энхансеров, которые пересекаются с генами, расположенными на обеих цепях. Затем рассчитывайте специфический для цепочек RPKM для генов, перекрывающихся энхансерами на одной цепи.

Затем введите команду для финализации назначения цепей для интергенных усилителей. Присваивать итоговую информацию по цепи всем интергенным усилителям и соответствующим регионам вершины. Введите команду в терминале для перехода в корневой каталог конвейера.

Затем используйте соответствующую команду для копирования скрипта для подготовки дальнейшего анализа. Используя соответствующую команду, подготовьте все необходимые файлы для агрегации энхансеров, обработки сигналов GRO-seq и количественной оценки РНК усилителя. Далее введите скрипт для входа в рабочую директорию, а затем скопируйте необходимые скрипты для дальнейшего анализа. Создание агрегационных графиков, показывающих сигнальные паттерны хроматина вокруг каждого типа вершины энхансера.

Введите соответствующую команду в терминале. После возврата запроса введёте команду для количественного определения уровней экспрессии РНК усилителя из GRO-seq с помощью подсчёта признаков. Наконец, запустите скрипт для визуализации и сравнения уровней экспрессии РНК энхансеров между группами энхансеров, используя R.In наборе данных GRO-seq.

Полинуклеотидные хвосты присутствовали до обрезки и успешно удалялись после применения параметров обрезки, нарушенные на конце ATAC-seq наборы данных. Последовательности адаптеров NextEra были обнаружены в обеих красных парах до обрезки и удалены после предварительной обработки наборов данных ChIP-seq для ацетилирования H3K27 показали минимальное загрязнение адаптера, требующее только стандартной обрезки. Фильтрация данных ATAC-seq выявила 71 165 немоторных открытых хроматиновых областей, включая 47 317 участков энхансеров, из которых 23 147 классифицированы как активные энхансеры и 24 170 — как неактивные энхансеры на основе перекрытия с гистоновыми метками, при этом 45,2% были интергенными, а 54,8% — внутригенными. Это распределение было похоже в категориях неактивных и активных энхансеров.

Интергенный энхансер выше гена NENO показал сильное обогащение сигналов ATAC-seq, монометилирования H3K4, ацетилирования H3K27 и сигналов GRO-seq. Интрагенный энхансер рядом с геном ИБС2 имел схожие хроматиновые и транскрипционные характеристики, как и энхансер NENOG, с чёткими сигналами во всех четырёх наборах данных. Графики агрегации показали, что активные энхансеры имеют согласованное обогащение сигналов ацетилирования ATAC-seq, H3K4 монометила и H3K27.

В то время как неактивные энхансеры не имели обогащения ацетилированием H3K27, но сохраняли сильные сигналы ATAC-seq и H3K4 монометил. Активные энхансеры показали значительно более высокую транскрипцию, полученную от GRO-seq, чем неактивные энхансеры как в интергенных, так и в интрагенных областях. Мы собираем те конвейеры вычислений eRNA с учётом тенденций, подтвержденных транскрипцией, зависящей от активности, в межгенном или внутригенном контексте.

Мы рассматриваем DER стандартизированной доступной количественной оценки eRNA, особенно для интрагенных энхансеров, запутанных геномом хозяина. Мы пересмотрим самостоятельную идентификацию, отделим операционные транскрипты от тенденций и проведём анализ бенчмарков по геномным сборкам, экспериментальным протоколам и типам клеток.