Простая техника микроаспирации для выделения соматических клеток из криоконсервированной спермы лошадей в качестве ядерных доноров для клонирования

Мы стремимся показать, что соматические клетки из криоконсервированной спермы лошадей могут быть полезны для восстановления особей с высокой генетической ценностью. Наша текущая задача — отобрать соматические клетки с целостной диплоидной ДНК для использования в качестве ядерного донора. Для начала достаньте конские соломинки спермы из резервуара с жидким азотом.

Подвергайте их воздействию воздуха на 10 секунд, а затем разморозите в водяной бане при 37 градусах Цельсия в течение 30 секунд. Возьмите образец размороженной спермы объёмом 250 микролитров. Разбавьте его одним миллилитром дополнительного DMEM-F12 среднего вещества.

Инкубировать семянную смесь при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Пипетить 25 микролитров из инкубированного разбавления в трубку и разбавить его в 975 микролитрах DPBS с добавлением 0,1 миллиграмма на миллилитр поливинил-спирта или поливинилпиролидона. Аккуратно перемешайте подвеску.

Поддерживайте разбавленную семянную смесь при 37 градусах Цельсия на протяжении всего процесса сбора клеток. Поставьте крышку чашки Петри с разбавленной спермой лошадей на стадию микроскопа для подготовки к сбору соматических клеток. Выберите микропипетку подходящего диаметра для сбора соматических клеток и подключите её к системе механической аспирации.

Аккуратно вставьте микропипетку в микрокапель и выровняйте её с основанием крышки посуды. После того как пипетка аспирирует культурную среду, начинайте индивидуальный захват соматических клеток. Сосредоточьтесь на нижней части микродропа, где видны различные морфологии клеток.

Разместите кончик микропипетки рядом с каждой соматической ячейкой и аспирируйте под отрицательным давлением. Собирайте круглые и вытянутые клетки, независимо от размера. После сбора 10 клеток положите их в микрокаплю объемом 10 микролитров, расположенную на верхней поверхности крышки посуды.

Сохраняйте все собранные соматические клетки внутри этой микрокапли на протяжении всего процесса сбора. После сбора нужного количества соматических клеток выполните простую процедуру промывания с помощью микрокапель для удаления сперматозоидов, мусора и микробных загрязнителей. Используя вторую крышку посуды, выполните последовательную трёхступенчатую промывку соматических клеток.

Используйте микропипетку, чтобы перенести соматические клетки в первую каплю и дайте им осесть на три-пять минут. Перенесите клетки с первой капли во вторую, используя ту же процедуру. Повторите перенос ещё раз и поместите соматические клетки в третью каплю.

Наконец, изолированные соматические клетки поместите в подготовленную микрокаплю, предназначенную для переноса ядра соматических клеток. Метод микроаспирации успешно восстановил соматические клетки из криоконсервированной спермы лошадей, при этом скорость захвата составляла от 317,7 до 424,7 клеток в час у трёх жеребцов. Жеребец номер 3 показал самый высокий урожай.

По размеру и морфологии было выделено пять различных типов соматических клеток. Мы выявили популяцию соматических клеток, отличающихся морфологией и жизнеспособностью криоконсервированной спермы лошадей, что может быть полезно в качестве ядерного донора. Клетки можно отбирать на основе их морфологии, и процедура не требует установления первичной культуры.

Мы сосредоточимся на повышении жизнеспособности этих клеток после увеличения спермы лошадей.