Окрашивание пероксисом в клетках млекопитающих с помощью пероксисоспецифических зондов

Поэтому наши исследования сосредоточены на изучении пероксисом, которые являются необходимыми органеллами для липидного обмена и клеточного окислительного баланса. Наша цель — выяснить, как регулируется их структура и функция, а также как эти процессы меняются при болезни. Для этого мы разрабатываем флуоресцентные зонды, которые позволяют нам и широкому научному сообществу визуализировать пероксисомы в различных клетках животных.

Здесь мы разрабатываем протоколы окрашивания, которые работают как в живых, так и в фиксированных клетках, предоставляя мощные инструменты для изучения биологии пароксетина в области здоровья и патологии. Одной из основных экспериментальных задач является достижение неинвазивной маркировки пероксисом в клетках животных. Хотя окрашивание антител помогает преодолеть эту проблему, существует дефицит коммерчески доступных антител к пароксизмальных белкам.

Ещё одна сложность — визуализация пероксисом, неинвазивных действий в реальном времени, что требует адаптивных протоколов. И наконец, традиционное окрашивание не обеспечивает функционального показания. Хотя окрашивание на основе пероксидазы может варьироваться в зависимости от пароксизмальной функции, что является и вызовом, и возможностью, поскольку позволяет различать пароксизмальные функциональные состояния внутри клетки.

Начните с клеток млекопитающих, посеянных накануне в тарелке с покрытиями, которые теперь имеют 30–70% совпадения. Разведите пероксисомный зонд свежими материалами в светочувствительной микроцентрифугированной трубке для достижения конечной концентрации в четыре микромоляра. Выберите нужный колодец для морилки и маркируйте снаружи маркером.

Аспирируйте 0,5 миллилитра материала из выбранной скважины и замените его подготовленным зондным материалом капля за каплей вдоль стенки скважины. После дозирования инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в течение 10–15 минут. С этого момента защищайте клетки от света с помощью алюминиевой фольги.

После инкубации аккуратно удалите окрашенные материалы и дважды промывайте клетки PBS. Затем поместите пластину под химический капюшон, добавьте 4% параформальдегида в PBS в клетки и инкубуйте при комнатной температуре в течение 20 минут. После фиксации уберите параформальдегид в специальный контейнер для отходов и промывайте клетки один раз PBS.

Далее добавьте 0,5% тритона X в PBS для проницаемости клеток и инкубации в течение 2,5 минут. После инкубации удалите Triton X и дважды промывайте клетки PBS по 10 минут каждая. Для блокировки клеток инкубировать их 5% бычьей сывороткой альбумином в PBS ночью при 4 градусах Цельсия.

Проведите процедуру иммунофлуоресцентного окрашивания согласно стандартному протоколу. Наконец, проведите микроскопию для получения изображений как фиксированных, так и живых клеток. Окрашивание живых клеток с помощью Peroxi_SPY зондов привело к импорту, зависящему от подсемейства D, в пероксисомы, что приводило к высокому соотношению пероксисомы к цитоплазменной флуоресценции в метаболически активных клетках.

В клетках дикого типа HEK-293T, экспрессирующих GFP-SKL, Peroxi_SPY555 окрашивание показало чёткую колокализацию с пероксисомами, тогда как в клетках PEX19 без пероксисом окрашивание отсутствовало. У фибробластов человека Peroxi_SPY окрашивание колокализовано с пароксизмальным маркером GFP-SKL, что подтверждает таргетирование пероксисом. Количественная оценка плотности пероксисомы выявила значительные вариации между различными типами клеток.

Оптимизированные условия окрашивания в клетках COS-7 с использованием 250 наномолярных Peroxi_SPY в течение 20 минут значительно увеличили соотношение флуоресценции пероксисомы к цитоплазме по сравнению с исходным протоколом одного микромоляра на 10 минут. Длительное инкубирование клеток HEK-293T с Peroxi_SPY в течение 24 часов привело к улучшению соотношения интенсивности флуоресценции пероксисомы и цитоплазмы по сравнению с 15 минутами, несмотря на снижение пероксисомного окрашивания. Протокол фиксации позволил успешно проводить ко-окрашивание антител, что было продемонстрировано благодаря сохранению Peroxi_SPY маркировке и иммунокрашивке анти-PEX14 в клетках HuH-7 и HEK-293T.

Количественная оценка показала, что процедуры фиксации и пермеабилизации влияют на интенсивность пероксисом-флуоресценции по сравнению с окрашиванием живых клеток. Мы разработали краситель Peroxi_SPY, который можно использовать для визуализации пероксисом как в живых, так и в фиксированных клетках животных. Наш флуоресцентный зонд может предложить простой и быстрый метод изучения динамики, гетерогенности и дисфункции пероксисом, которые ранее были ограничены.

Этот протокол позволит проводить исследования пероксисом, основанные на визуализации, в различных типах клеток, включая клетки, полученные пациентами с пароксизмальными заболеваниями.