Эффективная очистка эластиновых полипептидов (ELP) из E. coli с использованием метода экстракции и осадки на основе органических растворителей

Область данного исследования заключается в том, может ли осаждение экстракции растворителем быстро очищать белоки слияния ELP, сохраняя при этом функцию термоядерной активности. Недавние разработки включают быструю очистку ELP на основе растворителей с улучшенным контролем эндотоксинов, что позволяет создавать активные самособирающиеся наночастицы для таргетной доставки нуклеиновых кислот. Для начала взвесьте один грамм гранулы E.coli.

Добавьте четыре миллилитра свежеприготовленного буфера для лизиса, чтобы снова суспензировать клеточную гранулу. Аккуратно закрутите гранулу, пока гранула не будет полностью рассеяна и смешана с буфером. Добавьте примерно пять миллиграммов лизозима в восстановленные клетки для улучшения пищеварения клеточной стенки.

Затем поместите трубку на лёд и инкубируйте один час. После инкубации соникизируйте образец с помощью микро-наконечного зонда с интервалом в пять секунд. Держать образец на льду и продолжать соникацию, пока не получится равномерный лизат без видимых частиц, обычно в течение пяти-восьми минут.

Центрифугуйте соникатный лизат при 10 000 G в течение 10 минут при 20 градусах Цельсия для уточнения. Затем аккуратно отдельте супернатант, содержащий растворимую фракцию, от гранулы, содержащей нерастворимую фракцию. Пипетуйте 10–20 микролитров супернатанта и ресуспензуйте эквивалентную массу гранулы в лизисном буфере.

Смешайте обе фракции с 4x буфером Laemmli до конечной концентрации 1x. Затем нагрейте подвеску при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут. Если ELP преимущественно растворим, приступите к экстракции органическим растворителем с использованием просветлённого супернатанта.

Для экстракции растворителем добавьте четыре миллилитра органического растворителя или смеси растворителя в высушенную на воздухе гранулу или супернатант. Для бинарных смесей растворителей используйте точные объёмные соотношения, например, по два миллилитра каждого для комбинации один к одному. Энергично закрутите суспензию в течение одной минуты, чтобы обеспечить правильное проникновение растворителя в гранулу.

Теперь инкубировать смесь при 20 градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы обеспечить агрегацию внеклеточных белков и растворение ELP в органической фазе. Центрифугуйте образец при 13 000 G в течение 10 минут при 20 градусах Цельсия, чтобы отделить растворимые белки от нерастворимых обломков. Аккуратно собирайте супернатант, не нарушая гранулу, так как она содержит растворённый ELP.

Точно измеряйте объём собранного супернатанта, чтобы подготовиться к осадкам. Далее добавьте ацетон или ацетонитрил в супернатант в 2,33 раза больше объёма для осаждения белка. Инкубировать смесь при 20 градусах Цельсия в течение пяти-семи минут.

Центрифугуйте образец при 10 000 G в течение 10 минут при 20 градусах Цельсия. Затем сбросьте супернатант и высушите гранулу на воздухе либо под мягким струёй азота на 10–15 минут, либо положив открытые трубки центрифуг вверх ногами на салфетки без ворса в вытяжной вытяжке на один час при 20 градусах Цельсия. Суспензируйте высушенную белковую гранулу в 50 микролитрах PBS.

Затем аккуратно пипетить вверх и вниз, чтобы обеспечить полное растворение. Храните восстановленный суспендированный белок при минус 20 градусах Цельсия для краткосрочного и среднесрочного использования. Для проведения валидации с помощью SDS-PAGE сначала смешайте очищенный белок с 4x буфером загрузки SDS-PAGE.

Кратковременно используйте вихрь решения для однородности. Загрузите образец на гель 10% SDS-PAGE для слияния ELP и TEEN для хоризма мутазы. Пускайте гель на 100–120 вольт, пока отслеживающее погружение не достигнет дна.

Теперь окрашивайте гель морилкой InstantBlue Coomassie или подходящей альтернативой в течение двух часов при 20 градусах Цельсия. Промывайте деионизированной водой, пока не получится прозрачный фон. Заметный ELP и TEEN, слившись в хоризмационную мутазную полосу, появился при 100 килодальтонах после фазы лизиса перед органической экстракцией.

Различные комбинации органических растворителей приводили к различной эффективности экстракции и чистоте ELP и TEEN, соединённых с хоризматом мутазы. Однозначные смеси AG и BG обеспечили наивысшее восстановление белка. Растворитель AG, экстракцированный ELP и TEEN, сросшийся в хоризмат мутазы, сохранил примерно 80% своей ферментативной активности по сравнению с белком, очищенным ITC, в то время как BG сохранял около 50% активности, а контроль V40 почти не проявил активности.

Значимые результаты включают демонстрацию того, что осаждение с помощью органического растворителя быстро очищает слияния ELP с низким уровнем эндотоксина, сохраняя при этом активность синтеза белков. Этот протокол направлен на устранение отсутствия быстрых методов без моющих средств для очистки слияний ELP из E.Coli с включениями или без них без многоступенчатого ITC. Этот протокол обеспечивает быстрое очищение напрямую из гранул E.coli, обеспечивая высоко чистые слияния с низким содержанием эндотоксинов ELP при сохранении функции синтеза белков.