Определение микробной биомассы в почве с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR)
24 апреля 2026 г.
В данном исследовании представлен быстрый метод ddPCR для количественной оценки микробной биомассы почвы и соотношения грибковых к бактериям. Хотя микробная биомасса, полученная с помощью ddPCR, демонстрирует лишь слабую корреляцию с оценками фумигации хлороформа, метод обеспечивает чувствительный, масштабируемый молекулярный подход к оценке количества микробов без дополнительного отбора проб почвы или использования агрессивных препаратов.
В нашем исследовании используется капельное цифровое ПЦР и секвенирование целого генома для точной количественной оценки микробной биомассы на различных типах почвы. Традиционные методы требуют больших образцов почвы и вредных химикатов. ddPCR использует минимальную почву для абсолютного количественного оценки углерода генов и биомассы.
Для начала соберите реагенты из набора для экстракции почвенной ДНК, чтобы изолировать ДНК из почвенных микробов при комнатной температуре 20 градусов Цельсия. Ненадолго покрутите двухмиллилитровую трубку для биения бусины и убедитесь, что бусины осели на дне. Добавьте 100 миллиграммов почвы, затем 800 микролитров раствора CD1 и ненадолго перемешайте.
Используйте гомогенизатор для бисерной мельницы со скоростью шесть метров в секунду в течение 40 секунд, чтобы тщательно проанализировать образец и центрифугировать трубку для биения при 15 000 г в течение одной минуты при комнатной температуре для достижения механического лизиса ячеек. Перенесите супернатант, который всё ещё может содержать частицы почвы, в чистую двухмиллилитровую микроцентрифугную трубку. Добавьте 200 микролитров раствора CD2.
Вихрь в течение пяти секунд и центрифуга при 15 000 г в течение одной минуты. Передайте до 700 микролитров супернатанта в чистую двухмиллилитровую микроцентрифугную трубку, не нарушая гранулу. Добавьте 600 микролитров раствора CD3 в супернатант и вихрь на пять секунд.
Загрузите 650 микролитров смеси на спин-колонку и центрифугуйте при 15 000 г на одну минуту. Отбросьте проток и повторите процесс для оставшегося лизата. Далее поместите спин-колонку в чистую двухмиллилитровую трубку для сбора трубок.
Добавьте 500 микролитров раствора EA в спин-колонку и центрифугуйте при 15 000 г на одну минуту при комнатной температуре. Отбросьте проточную трубу и поместите спин-колонку обратно в ту же трубку для сбора. Добавьте 500 микролитров раствора C5 в спин-колонку и центрифугу, как показано ранее.
После отброса протока поместите спин-колонку в новую двухмиллилитровую сборную трубку и центрифугу при 16 000 г на две минуты при комнатной температуре. Поместите спин-колонку в новую элюционную трубку объемом 1,5 миллилитра. Добавьте от 50 до 100 микролитров раствора C6 в центр фильтрующей мембраны спин-колонки.
Центрифугу при 15 000 г на одну минуту. После отброса спин-колонки храните трубку с элюэнтом при четырёх градусах Цельсия. Измерьте экстракционную ДНК с помощью флуорометра и двухцепочечного ДНК-анализа широкого спектра в соответствии с инструкциями производителя.
Для анализа бактерий и грибов выбирайте специфические праймеры 16S рРНК и 18S рРНК. После оттаивания заглушите все реагенты на лёд. Настройте цифровую капельно-полимеразную цепную реакцию, или ddPCR.
Вставьте картридж генератора капель, или DG8, в держатель картриджа. Добавьте всего 20 микролитров реакционной смеси в каждую ямку для образцов в картридже. Затем добавьте 70 микролитров масла для генерации капель для Evagreen в хорошо маркированное масло картриджа.
Вставьте картридж в генератор капель и накройте его прокладкой. Перенесите 40 микролитров сгенерированных капель в каждую яме 96-ядровой полуюбкой пластины для усиления ПЦР. Запечатайте пластину с помощью герметика, установленного на 180 градусов Цельсия, на пять секунд.
Настройте профиль термического цикла и установите нагретую крышку на 105 градусов Цельсия. После завершения ПЦР переносите 96-ядровую пластину на считыватель пластин. Используя QuantaSoft версии 2.1, отрегулировать порог амплитуды для разделения отрицательных и положительных капель.
Из каждой скважины оценивайте параметры, такие как количество копий генов на нанограмм ДНК, общее количество копий генов на нанограмм извлеченной ДНК, копии генов на грамм сухого веса обработанной при извлечении почвы и количество клеток на грамм сухого массы почвы. Далее рассчитайте микробный биомассовый углерод, или MBC, соответствующий содержанию бактерий и грибов на грамм сухого веса почвы на колодцу. Трёхкратный анализ почвенной ДНК из пяти мест дал среднюю концентрацию микробной ДНК от 32 до 4 590 нанограммов на грамм сухой почвы на образец.
Почва B содержала наименьшее количество копий гена 16S рРНК — в среднем 8,8 раза 10 к степени семи и 18S рРНК — в среднем 4,6 раза 10 к степени шести на грамм сухой почвы. В отличие от этого, почва E имела наибольшее количество копий генов 16S и 18S рРНК — в среднем 4,4 раза на 10 степени девяти и 2,5 умножить на десять к степени девяти соответственно на грамм сухой почвы, что значительно отличается от всех остальных образцов. Хотя грибные копии оставались схожими на почвах A, B, C и D, количество бактерий в почве D значительно отличалось от B и E. Наибольшее содержание микроорганизмов наблюдалось в почве E, а самое низкое — в образцах, взятых из почвы B, что значительно отличалось от A, D и E. Этот протокол позволяет исследователям измерять динамику и структуру почвенных сообществ с помощью микробной биомассы и соотношения грибков к бактериям.
Та же шаблонная ДНК, используемая для цифровой ПЦР с каплями, может применяться для секвенирования ДНК, чтобы обеспечить микробное сообщество и функциональный анализ.
Обзор
В данной статье представлен оптимизированный рабочий процесс для количественного определения содержания бактерий и грибов в почве с использованием цифровой капельной ПЦР (ddPCR), направленной на гены 16S и 18S рРНК. Протокол позволяет проводить абсолютный количественный анализ копий микробных генов, пересчитывать их в количество клеток и оценивать содержание микробного биомассового углерода (MBC). Метод сравнивается с традиционной экстракцией с фумигацией хлороформом и демонстрируется на образцах почв из пяти сельскохозяйственных систем, распределенных по всему миру.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология почвы
- Молекулярная экология
- Экология и охрана окружающей среды
Теоретическое обоснование
- Почва представляет собой крупнейший наземный резервуар органического углерода, однако за последние два столетия произошли значительные потери углерода.
- Микробная биомасса, особенно грибы и бактерии, обеспечивает круговорот углерода и питательных веществ в почвах.
- Традиционные методы количественного определения микробной биомассы имеют ряд ограничений, включая необходимость в большом количестве образцов и неопределенность при пересчете данных.
- Для оценки состояния здоровья почвы необходимы точные, масштабируемые и чувствительные методы.
Цель исследования
- Разработать и валидировать протокол на основе ddPCR для количественного определения содержания бактерий и грибов в почве.
- Сравнить оценки микробной биомассы, полученные с помощью ddPCR, с традиционными методами фумигации хлороформом.
- Оценить применимость данного протокола для различных типов почв и сельскохозяйственных систем.
Используемые методы
- Экстракция ДНК из почвы с использованием протокола с механическим разрушением тканей (bead-beating) и центрифужным сорбционным методом.
- Количественное определение экстрагированной ДНК с помощью флуориметра и набора для анализа в широком диапазоне концентраций.
- Проведение кДР-ПЦР (ddPCR) для анализа генов 16S рРНК (бактерии) и 18S рРНК (грибы) с использованием специфических праймеров.
- Расчет числа копий генов, количества клеток и содержания углерода микробной биомассы на грамм сухой почвы.
- Сравнение результатов кДР-ПЦР с данными экстракции методом фумигации хлороформом и полногеномного секвенирования.
Основные результаты
- Метод ddPCR обеспечил абсолютный количественный анализ копий бактериальных и грибковых генов в образцах почвы с высоким разрешением.
- Концентрация микробной ДНК в образцах варьировалась от 32 ng до 4,590 ng на грамм сухой почвы.
- Наивысшее содержание микроорганизмов наблюдалось в почве E, а наименьшее — в почве B.
- Метод ddPCR позволил получить более широкие и чувствительные оценки соотношения грибов к бактериям (F:B), чем полногеномное секвенирование.
- Значения MBC, полученные с помощью ddPCR, показали лишь слабую корреляцию с результатами хлороформного фумигационного метода.
Выводы
- Протокол ddPCR представляет собой воспроизводимый, масштабируемый и чувствительный подход для количественного определения численности и биомассы почвенных микроорганизмов.
- Данный метод позволяет улучшить оценку таких экологических показателей, как соотношение F:B.
- ddPCR может быть интегрирован с композиционным анализом для совершенствования исследований и оценки состояния здоровья почвы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Точное количественное определение микробной биомассы почвы имеет решающее значение для понимания экологических факторов цикла углерода и оборота питательных веществ, что может способствовать поиску новых биофармацевтических препаратов в исследованиях экологического микробиома. Цифровая капельная ПЦР (ddPCR) позволяет осуществлять абсолютное высокоразрешающее измерение численности бактерий и грибов, обеспечивая надежную проверку гипотез и снижение механистических рисков на ранних стадиях НИОКР. Данный молекулярный подход повышает прогностическую достоверность трансляционных исследований с использованием микробных систем почвенного происхождения.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Обеспечивает точную количественную оценку копий микробных генов для валидации функциональных мишеней в образцах окружающей среды.
- Способствует снижению механистических рисков за счет разграничения вклада бактерий и грибов в почвенные процессы.
- Облегчает проверку гипотез относительно структуры микробного сообщества и его влияния на биогеохимические циклы.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает стандартизированное и воспроизводимое количественное определение содержания микроорганизмов для последующих этапов скрининга.
- Позволяет получать количественные данные, подходящие для калибровки анализа и сравнения результатов между разными лабораториями.
- Обеспечивает возможность масштабируемой оценки микробной биомассы в различных типах почв, что способствует повторному использованию платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет показатели микробного обилия с экологическими индикаторами, такими как соотношение грибов к бактериям (F:B), для обеспечения трансляционной значимости.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичных открытий до доклинической валидации в исследованиях с использованием почвенных микробиомов.
- Оптимизирует принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков за счет обеспечения чувствительного абсолютного количественного определения углерода микробной биомассы.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный рабочий процесс на основе ddPCR интегрируется в континуум от этапа поиска до доклинических исследований для научно-исследовательских разработок в области экологии и микробиома.
- Открывающая биология: обеспечивает надежную проверку гипотез и уточнение метаболических путей путем количественного определения содержания микробных генов и углерода биомассы.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые количественные результаты для разработки анализов и подготовки к скринингу.
- Аналитика: обеспечивает абсолютные измерения количества копий генов и числа клеток, что позволяет проводить статистическое сравнение в различных условиях.
- Трансляционные исследования: способствуют согласованию с экологическими и функциональными биомаркерами, имеющими значение для здоровья почвы и динамики микробных сообществ.
- Корпоративное повторное использование: предлагает масштабируемую воспроизводимую молекулярную платформу, адаптируемую к различным почвенным и природным системам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неоднозначность в исследованиях экологического микробиома.
- Операционная ценность: Стандартизирует количественное определение микроорганизмов при минимальном объеме пробы и высокой воспроизводимости.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает принятие обоснованных решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) и капиталоэффективное управление портфелем в области НИОКР по микробиому почвы.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ поиска новых решений на основе данных о почвенных микроорганизмах.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области молекулярной биологии и методов количественной ПЦР.
- Необходим доступ к оборудованию для кДПЦР, средствам флуорометрического количественного определения и аналитическому программному обеспечению.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов экстракции и количественного определения ДНК.
- Метод применим к различным типам почв, однако может потребоваться оптимизация для различных матриц.
- На интерпретацию содержания углерода микробной биомассы могут влиять поправочные коэффициенты числа копий генов и неоднородность почвы.
