Флуоресцентная кальциевая визуализация в первичных эпителиальных культурах дыхательных путей человека с использованием автоматизированной сегментации клеток
22 мая 2026 г.
Живоклеточная визуализация кальциевых сигналов широко используется для изучения мобилизации кальция в стабильных клеточных линиях, выращенных в монослойках. Этот протокол описывает флуоресцентную визуализацию кальциевых сигналов живыми клетками с использованием живых клеточных красителей на сложных первичных тканях, а также использует программное обеспечение машинного обучения для количественной оценки флуоресцентной интенсивности тысяч отдельных клеток одновременно, тем самым упрощая ан
Одноклеточная транскриптомика выявляет гетерогенность в эпителии дыхательных путей при муковисцидозе. Мы стремимся понять, как специфические функции и изменения клеточных типов влияют на патогенез заболеваний. Текущая задача заключается в точном измерении протеомики и функций отдельных клеток.
Это всё ещё требует технической разработки. Для начала храните клетки Calu-3 в колбах T-25, содержащие минимальную необходимую среду культуры Eagle's Minimum Essential Medium Culture, дополненную 20% FBS и 1% пенициллин стрептомицином. Когда клетки достигнут примерно 70% слияния, промывайте их пятью миллилитрами PBS.
После мытья добавьте один миллилитр TrypLE прямо на клетки и поставьте колбу в инкубатор, настроенный на 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа на 10–15 минут. Затем нейтрализуйте TrypLE, добавив четыре миллилитра свежей полной культурной среды, и тщательно перемешайте суспензию клетки. Заместить клетки в пластину из 96 ядок примерно с 90%–100%, что соответствует примерно 40 000 клеток на яму.
Дайте ячейкам прилипнуть к пластине с 96 лунками в течение ночи. Меняйте среду каждый день и продолжайте культивировать клетки в течение двух-пяти дней после слияния, чтобы обеспечить дифференциацию. В день эксперимента промыйте клетки Calu-3 и инкубируют их соответствующими красителями.
Далее добавьте 100 микролитров на каждую скважину 2,5 миллимолярного пробенецида, разбавленного в кальциевом буфере, чтобы сохранить краситель в цитоплазматическом пространстве, и оберните пластину алюминиевой фольгой, чтобы защитить её от света до проведения визуализации. Для первичных клеток дыхательных путей. Удалите базолатеральную среду из трансвелла и промыйте апикальную сторону, добавив 300 микролитров кальциевого буфера.
Затем промой базолатеральную сторону, добавив 750 микролитров кальциевого буфера. Снимите буфер с помощью пипетки и повторите промывку с обеих сторон. Далее инкубировать клетки с 200 микролитрами раствора красителя на апикальной стороне и 600 микролитрами на базолатеральной стороне в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.
Во время инкубации приготовьте тапсигаргин, разбавленный в кальциевом буфере, в виде трёхкратного промежуточного запаса. Отрегулируйте концентрацию до шести микромоляров, чтобы получить итоговую концентрацию в два микромоляра в яме. После инкубации удалите раствор красителя из апикальных и базолатеральных компартментов с помощью пипетирования.
Промыйте клетки дважды 300 микролитрами кальциевого буфера с апикальной стороны и 750 микролитрами кальциевого буфера с базолатеральной стороны. Затем снимите буфер с помощью пипетирования. Далее добавьте 100 микролитров 2,5 миллимолярного пробеницида в кальциевом буфере в апикальный компартмент и 500 микролитров того же раствора в базолатеральный компартмент.
Оставляя вставку Transwell внутри пластины, обмотайте всю пластину алюминиевой фольгой для защиты от света и отложите обёрнутую пластину для съёмки. Откройте заявку на Фиджи. Выберите «Файл» и выберите «Открыть», чтобы загрузить видеофайл.
В полученном всплывающем окне сохраните все настройки по умолчанию и подтвердите выбор. Если хотите, настройте отображение изображения, выбрав «Изображение», «Настроить» и нажать «Контраст яркости». Модифицировать яркость и контраст отдельных флуоресцентных каналов для достижения оптимального обзора клеток.
Для облегчения трассировки ячеек объедините каналы, выбрав Изображение, Цвет и нажав Объединить каналы. В всплывающем окне назначите соответствующие файлы каждому отдельному каналу и подтвердите выбор. Для отслеживания выберите Анализ, Выберите инструменты и откройте ROI Manager.
В полученном всплывающем окне включите опции «Показать всё» и «Метки». С помощью инструмента свободного выбора тщательно обведите отдельные клетки по границам ячеек и ядерной окрашиванию. Затем нажмите клавишу T, чтобы добавить каждую обведённую ячейку в список ROI.
Убедитесь, что ячейки обведены во всех четырёх углах поля зрения и в центре видео. После того как все ячейки будут точно отследены, в окне ROI Manager нажмите More и выберите Multimeasure. В полученном всплывающем окне нажмите OK, чтобы начать измерение.
Откройте видеофайл на Фиджи. Оптимизируйте ядерный и зелёный флуоресцентные каналы для просмотра с помощью инструментов корректировки изображения. После оптимизации каналов дублируйте один кадр, выбрав Изображение и Дублируйте.
В полученном всплывающем окне снимите опцию Duplicate stack и сохраните дублированное изображение как PNG-файл. Повторите дублирование кадра для другого канала, выбрав Изображение и Дубликат. В всплывающем окне нажмите OK, и сохранить изображение — это PNG-файл.
Объедините два сохранённых изображения, выбрав «Изображение», «Цвет» и нажав «Объединить каналы». Затем назначьте каждый PNG-файл соответствующему каналу и подтвердите слияние. Загрузите объединённое изображение в постграфический интерфейс ячейки для создания маски ячейки.
Сегментируйте изображение, используя ядерное окрашивание как канал один, и цитоплазматическое окрашивание становится каналом второго, выбрав модель cyto3. Теперь сохраните сгенерированное изображение маски в формате PNG. Откройте его на Фиджи и конвертируйте в TIFF-файл.
Наконец, откройте и файл маски, и оригинальный видеофайл в кальциевом наборе, перетаскивая их в программный интерфейс. Нажмите «Анализировать данные», чтобы сгенерировать скачиваемый график и скачиваемый CSV-файл с нормализованными и сырыми значениями интенсивности для всех анализируемых ячеек. Интенсивность флуоресценции, нормализованная до исходного уровня, со временем увеличилась в отдельных клетках Calu-3 после стимуляции тапсигаргина при измерении с использованием Fluo-4 AM и Cal-520 AM, максимальная кальциева-зависимая активация флуоресценции после тапсигаргина была значительно выше в клетках Calu-3, измеренных с Cal-520 AM, по сравнению с Fluo-4 AM. Аналогично, отдельные первичные дыхательные пути и бронхиальные клетки демонстрировали повышенную нормализованную флуоресценцию со временем после стимуляции тапсигаргина с использованием любого из красителей.
Кроме того, максимальная кальциева-зависимая флуоресцентная активация была значительно выше в клетках, нагруженных Cal-520 AM. Анализ на основе машинного обучения выявил и количественно оценил кальциевые флуоресцентные изменения в 1 441 отдельной клетке с одного поля зрения. Нормализованные флуоресцентные следы, полученные программным обеспечением, показали кальциевые ответы для всех 1 441 идентифицированных клеток после стимуляции тапсигаргином. Наши исследования помогут понять реакцию различных типов клеток на окружающую среду, что поможет разработке таргетных терапевтических средств.
Наши результаты могут сосредоточиться на различных типах клеток, назначить определённые реакции живых клеток на воздействия окружающей среды. В будущем мы намерены изучить, как изменяется специфическая к типу клеток сигнализация в болезни и здоровых клетках, чтобы определить, какие именно они ответственны.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол мониторинга кальциевой сигнализации в живых клетках с одноклеточным разрешением в первичных культурах эпителия дыхательных путей. Метод сочетает использование экзогенных флуоресцентных индикаторных красителей, передовую эпифлуоресцентную микроскопию и новое программное обеспечение на базе машинного обучения для сегментации клеток и количественного анализа. Данный подход обеспечивает быстрый, непредвзятый и высокопроизводительный анализ потока ионов кальция в сложных эпителиальных тканях, что способствует изучению специфических ответов различных типов клеток, имеющих значение для патогенеза заболеваний и разработки терапевтических методов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология клетки
- Кальциевая сигнализация
- Исследование эпителия дыхательных путей
- Визуализация и компьютерный анализ
Теоретические основы
- Кальциевая сигнализация имеет важное значение для многочисленных биологических процессов.
- Изучение потоков кальция с разрешением до одной клетки в первичных культурах эпителия представляет собой сложную техническую задачу.
- Существующим методам часто не хватает возможности разделять ответы отдельных клеток в сложных тканях.
- Машинное обучение открывает новые возможности для непредвзятого высокопроизводительного анализа данных визуализации.
Цель исследования
- Разработка и валидация протокола визуализации кальция в живых клетках первичных культур эпителия дыхательных путей.
- Обеспечение анализа мобилизации кальция с одноклеточным разрешением с использованием клеток, полученных от пациентов.
- Внедрение программного обеспечения на базе машинного обучения для автоматической сегментации клеток и количественной оценки флуоресценции.
Используемые методы
- Культивирование клеток Calu-3 и первичных эпителиальных клеток дыхательных путей на границе раздела воздух-жидкость (ALI).
- Загрузка клеток экзогенными флуоресцентными индикаторами кальция (Fluo-4 AM и Cal-520 AM).
- Стимуляция тапсигаргином для индуцирования мобилизации кальция.
- Эпифлуоресцентная микроскопия для визуализации потока кальция в живых клетках.
- Ручная сегментация клеток и сегментация на основе машинного обучения с использованием Fiji и специализированного программного обеспечения.
- Количественный анализ изменений интенсивности флуоресценции на уровне отдельных клеток.
Основные результаты
- Как клетки Calu-3, так и первичные клетки дыхательных путей продемонстрировали увеличение нормализованной флуоресценции после стимуляции тапсигаргином, что указывает на мобилизацию кальция.
- Краситель Cal-520 AM обеспечил значительно более высокую максимальную кальций-зависимую активацию флуоресценции по сравнению с Fluo-4 AM.
- Анализ на основе машинного обучения позволил идентифицировать и количественно оценить кальциевые ответы в 1 441 отдельной клетке в одном поле зрения.
- Кривые нормализованной флуоресценции выявили отчетливые кальциевые ответы во всех проанализированных клетках.
Выводы
- Данный протокол позволяет проводить быстрый, объективный и высокопроизводительный анализ кальциевой сигнализации с разрешением до одной клетки в первичных культурах эпителия.
- Сегментация и анализ на основе машинного обучения повышают точность и масштабируемость исследований отдельных клеток.
- Этот подход облегчает выявление ответов, специфичных для конкретных типов клеток, что способствует дальнейшим исследованиям механизмов заболеваний и разработке таргетной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественная визуализация уровня кальция в отдельных клетках первичных культур эпителия дыхательных путей человека позволяет восполнить критический пробел в понимании специфической для каждого типа клеток сигнализации, имеющей значение для патогенеза респираторных заболеваний. Автоматическая сегментация клеток с использованием машинного обучения обеспечивает масштабируемый и непредвзятый анализ, что повышает прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и валидации мишеней. Эта возможность оптимизирует принятие решений по портфелю препаратов, проясняя функциональную гетерогенность и обеспечивая трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать специфические для конкретных типов клеток пути передачи кальциевых сигналов в первичных тканях человека.
- Способствует снижению биологических рисков за счет количественной оценки функциональной гетерогенности на уровне отдельных клеток.
- Повышает прогностическую уверенность в валидации мишеней благодаря надежным количественным показателям.
- Обеспечивает понимание механизмов клеточных ответов, имеющих значение для заболевания, для приоритизации портфеля препаратов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Позволяет подготавливать валидированные, физиологически релевантные эпителиальные системы для последующего использования в скрининговых рабочих процессах.
- Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых и количественных результатов флуоресцентного анализа.
- Обеспечивает возможность высокопроизводительного автоматизированного анализа, подходящего для масштабируемой оценки соединений.
- Поддерживает повторное использование платформы анализа для различных моделей заболеваний дыхательных путей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Позволяет сопоставить результаты функционального анализа отдельных клеток с биомаркерами заболеваний в эпителии дыхательных путей.
- Обеспечивает трансляционную преемственность от культур, полученных из тканей пациентов, до доклинической валидации.
- Обосновывает решения о продвижении проекта с учетом рисков путем уточнения ответов конкретных типов клеток.
- Снижает риски при проверке механистических гипотез перед проведением исследований in vivo.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод объединяет этапы от раннего поиска до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, предоставляя воспроизводимый рабочий процесс для функционального анализа в первичных моделях дыхательных путей человека.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем количественного определения потока ионов кальция в отдельных типах клеток.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для подтверждения готовности анализа и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет нормализованные измерения интенсивности флуоресценции и статистические данные для надежного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: связывает ответы отдельных клеток in vitro с трансляционными биомаркерами, имеющими значение для заболевания.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую автоматизированную систему для многократного использования в портфелях исследований заболеваний дыхательных путей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует и автоматизирует анализ единичных клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет уточнения функциональной гетерогенности.
- Влияние на портфель: способствует приоритезации с учетом рисков и продвижению программ по исследованию респираторных заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток, флуоресцентной микроскопии и компьютерного анализа.
- Зависит от наличия эпифлуоресцентных микроскопов и программного обеспечения для сегментации на основе машинного обучения.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов визуализации и анализа.
- Может потребоваться адаптация для различных первичных источников тканей или моделей заболеваний.
- Пропускная способность и масштабируемость зависят от инфраструктуры визуализации и вычислительных ресурсов.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:23
Calu-3 Cell Culturing for Live Calcium Imaging
1:40
Loading Calu-3 Cells and the Primary Airway Cells with Cal-520 AM or Fluo-4 AM
3:51
Calcium Imaging Analysis Using the Fiji Software
5:28
Calcium Imaging Analysis Using the Calcium Suite
7:13
Results
8:31
Conclusion
