Воспроизводимая установка для in vivo двухфотонной визуализации сократимости шейных лимфатических сосудов и лимфатического потока у мышей

Мы предлагаем необходимость новой визуализации сократечимости шейных лимфатических сосудов и лимфатического удаления эритроцитов у мышей. Изучение функций шейных лимфатических сосудов является сложной задачей, особенно при длительном наблюдении за сокращением лимфатического потока и трасерных циркуляций. Для начала установите стальную оптическую рельсу длиной 270 миллиметров и шириной 43 миллиметра в качестве основания устройства.

Установите два держателя для стойк на стальной оптической рельсе, обеспечив расстояние между ними в 175 миллиметров. Вставьте в держатели два крепления диаметром 12 миллиметров и закрепите каждый винтом M6. Затем к каждому из двух крепежных столбов прикрепите ошейник для столба.

Закрепите прямоугольный, фиксированный зажим на одном из крепежных столбов и крепко закрепите его винтом M6. Вставьте 12-миллиметровый крепительный штифт в боковое отверстие прямоугольного зажима. Прикрепите 3D-печатный держатель к вставленному боковому креплению и надёжно закрепите его двумя парами винтов M3.

С помощью клея, отверждаемого ультрафиолетом, прикрепите стекло диаметром 12 миллиметров к нижней стороне защитного 3D-печатного корпуса. Затем закрепите защитный корпус к держателю с 3D-печатью с помощью пары винтов/гайок M4. Установите прецизионный пантографический стол для вертикального перемещения на стальной оптической рельсе с помощью двух зажимов стола и комплектов винтов, гайок и шайб M6.

Затем положите на стол 3D-напечатанный кейс длиной 155 миллиметров и шириной 110 миллиметров. Этот ящик служит резервуаром для накопления солёного раствора. Накройте точку соединения проводов с нагревательным элементом один тонким слоем силикона.

Прикрепите датчик температуры один к коврику и запечатайте его силиконом. Припаяйте провода нагревательного элемента и датчики температуры к многопроводному кабелю. Заполните точку соединения силиконом и закройте его термоусадочной пленкой.

Вставьте нагревательный элемент два и датчик температуры два в поролоновый ролик. Закрепите разъёмы для кабеля питания и кнопку питания на стенках корпуса блока управления. Установите внутри корпуса блок питания на 24 вольта постоянного тока, понижающий преобразователь постоянного тока и два модуля MOSFET.

После сборки схемы и пайки необходимых компонентов закрепите Arduino Uno и экран клавиатуры в корпусе крышки. Найдите поле выбора температуры. Отрегулируйте температуру и нажмите run.

После анестезии мыши нанесите глазную мазь на обе веки, чтобы предотвратить высыхание глазных яблок во время операции. Когда рефлексы отъёма задних лап и подгибания хвоста прекратятся, положите мышь на спину на нагревательный элемент, чтобы обеспечить доступ к брюшной области. Подключите управляющий блок к электрической розетке с входным напряжением от 175 до 240 вольт переменного тока.

С помощью медицинской ленты закрепите тело животного в положении, параллельном поверхности стола, и разместите голову под углом к сагиттальной оси так, чтобы одна сторона шеи опиралась на ролик. Обмотайте верхние резцы лигатурой, прикрепите её к задней части устройства и используйте медицинский скотч для поддержания температуры тела животного. Далее сбрийте шерсть в области шеи.

Затем удалите оставшиеся волосы и накройте животное, чтобы сохранить стерильное поле. Для первичной дезинфекции дезинфицируйте кожу шеи спиртовым мазком. Затем примените раствор 0,5% хлоргексидина или 2% йода для обработки антисептиками и повторите процесс дезинфекции ещё два раза.

После подтверждения глубины анестезии с помощью рефлекса «щипка пальцев» выполните дерматотомию, сделав продольный разрез по коже шеи от нижней челюсти до ключицы длиной примерно два сантиметра. Затем выполните фасциотомию с помощью микрохирургических изогнутых ножниц. С помощью изогнутого пинцета аккуратно отодвигайте в сторону слюнные железы и поверхностные мышцы шеи, чтобы обнажить грудно-ключно-соместовидную мышцу.

Убедитесь, что видимые кровеносные сосуды не повреждены, и постоянно увлажняйте хирургическое поле физиологическим раствором, чтобы предотвратить повреждение тканей. Используйте микрохирургические ножницы для проведения миотомии грудино-ключовидной мышцы, обеспечив доступ к области между трахеей и сонной артерией. Продолжайте расширять мышцы и фасцию, выполняя как миотомию, так и фасциотомию.

Далее определите глубокий шейный лимфатический узел вместе с афферентными и эфферентными лимфатическими сосудами на глубине от пяти до семи миллиметров. Поставьте устройство, удерживающее неподвижное животное, на подвижный стол для микроскопа. И закрепите устройство, плотно закрепив его винтом M6 для обеспечения стабильности во время съёмки.

Прикрепите катетер, предварительно наполненный физиологическим раствором, к стойке с помощью медицинской ленты. Поставьте ролик диаметром один сантиметр под нагревательный элемент сбоку головы животного, чтобы поддерживать наклон 45 градусов относительно стола микроскопа. Затем разместите фиксированный катетер в хирургически открытой области шеи так, чтобы он находился рядом с ключицей животного, и включите подачу физиологического раствора, чтобы заполнить открытую полость шеи физиологическим раствором.

Опустите защитную оболочку над областью шеи, заполненную физиологическим раствором, чтобы лимфатический сосуд находился в центре обзорного поля. Затем защитная оболочка накладывается на трахею без давления. Наконец, опустите двухфотонную линзу без погружения в защитную оболочку на нужную глубину, исходящую от рабочего расстояния линзы, и проведите двухфотонную визуализацию шейного лимфатического сосуда.

После процедуры успешная идентификация глубоких шейных лимфатических узлов была подтверждена накоплением синдрома Эванса Блю в ткани. До и после фотомодуляции был проведен двухфотонный мониторинг сократимости шейного лимфатического сосуда. Фотобиомодуляция значительно увеличила сократительность шейных лимфатических сосудов у мышей 2 и 18 месяцев с похожей интенсивностью.

Количественный анализ показал, что сократимость шейных лимфатических сосудов была значительно ниже у 24-месячных мышей по сравнению с мышами 2 и 18 месяцев. Однако значения не отличались существенно между мышами 2 и 18 месяцев. Фотобиомодуляция значительно увеличила сократимость шейных лимфатических сосудов у мышей 2 и 18 месяцев, но не повлияла на 24-месячных мышей.

Эритроциты, введённые в правый латеральный желудочек, наблюдались в шейных лимфатических сосудах через четыре часа после инъекции и продолжали движение по просвету через пять часов, подтверждая направленный поток из мозга в периферию. Наш протокол позволяет проводить in vivo мониторинг функции шейных лимфатических сосудов при сохранении сократимости до пяти часов наблюдения. Наш метод обеспечивает хорошую воспроизводимость и совместим с различными двухфотонными микроскопами и объективными линзами, при этом сохраняя высококачественное изображение на глубине до 500 микрометров.

Эта техника потенциально может стать универсальным инструментом для изучения физиологии дренажной системы мозга и функций шейных лимфатических сосудов.