Внутримышечная трансплантация эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных из множественных стволовых клеток человека, у мышей
10 апреля 2026 г.
Мы предлагаем минимально инвазивный протокол для внутримышечной трансплантации островков поджелудочной железы, полученных из человеческих стволовых клеток, в иммунодефицитных мышей для имплантации in vivo и дальнейшего анализа.
Мы изучаем развитие эндокринной поджелудочной железы человека с использованием глаз, полученных из стволовых клеток, чтобы понять генетическую основу диабета. Традиционная трансплантация капсул почки является крайне инвазивной. Протокол внутримышечной трансплантации предлагает более простую, воспроизводимую и минимально инвазивную альтернативу.
Для начала добавьте 0,5 миллилитра 5%-анти-адгерентного раствора, чтобы покрыть дно пластины с 24 лунками, содержащей перевернутые пирамидальные микроскважины. Центрифугуйте пластину при 1 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем изучите микроскважины под микроскопом на наличие воздушных пузырьков.
После повторного центрифугирования пластины, чтобы удалить захваченный воздух, аспирируете антиадгерентный раствор. Затем помойте каждую скважину с 0,5 миллилитрами PBS и повторите этот этап промывания ещё раз. Далее промыть культивированные предки поджелудочной железы, полученные из hPSC, с помощью одного миллилитра PBS с 0,5 миллимолярной ЭДТА.
Аспирируйте PBS с 0,5 миллимолярной ЭДТА и покройте колодцы трипсином. Затем инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение восьми-двенадцати минут. Разведите трипсин двумя объёмами DMEM/F12 или PBS и аккуратно подвесьте клетки с помощью пипетирования.
Перенесите подвеску в коническую трубку и сразу переходите к следующему этапу. Центрифугуйте подвеску при 200 г в течение трёх минут при комнатной температуре. Аккуратно аспирируйте супернатант и аккуратно снова суспензуйте гранулу в предварительно подогретой среде S4.
Далее аспирируйте PBS из тарелок MicroWell. Аккуратно добавьте 1,25 миллилитра взвешенных клеток в каждую яме пластины микроколодца. Центрифугуйте пластину при 100 г в течение трёх минут при комнатной температуре, чтобы равномерно распределить клетки в микроколодцах.
Аккуратно перенесите пластину микроколодца в увлажнённый инкубатор. Для изменения среды с помощью дифференциационных сред аккуратно аспирируете и распределяйте среду вдоль стенок колодца, чтобы предотвратить турбулентность и вытеснение клеточных кластеров из микроскважин. После передачи нужного количества генерированных кластеров в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 миллилитра подключите шприц к игольной трубке и заполните его средой S7.
Аспирируйте кластеры в трубку непосредственно из микроцентрифугальной трубки. Согните трубку пополам и вставьте сложенный участок в наконечник пипетки объемом 200 микролитров. Затем вставьте иголку трубки в коническую трубку объёмом 15 миллилитров и закрепите концы на краю трубки с помощью ленты.
Центрифугуйте трубку при 100 г на две минуты при 4 градусах Цельсия, чтобы уплотнить скопления, и сразу же поставьте трубку на лёд. Чтобы пересадить кластеры в анестезированные NOD scid гамма-мыши, побрить медиальную часть правой ноги ниже колена и продезинфицировать 70% этанолом. Затем отсоедините трубку от кончика пипетки и подключите её к шприцу.
Отрежьте трубку близко к уплотнённым кластерам и прикрепите её к тупому концу иглы. Вдавливайте физиологический раствор, пока первый пучок не достигнет кончика иглы. Затем расположите мышь на землю, наклонившись вправо, и вытяните правую ногу.
Введите иглу на глубину четырёх-пяти миллиметров в медиальный отсек правого бедра между приводящей и грацилисной мышцами. Затем вводите кластеры, убирая иглу примерно на три миллиметра. Поверните шприц, уберите иглу и дайте мыши восстановиться.
После восстановления трансплантата через шесть недель после трансплантации и сечения тканей проводите иммунокрашивание для дальнейших визуализации. Одноклеточные суспензии предшественников поджелудочной железы четвертой стадии были размещены в микроколодцах, чтобы получить трёхмерные агрегаты с контролируемым размером. В течение 24–48 часов образовались компактные сферические скопления.
Флуоресцентная микроскопия подтвердила наличие PDX1 и экспрессирующих инсулиновых клеток в репортерных линиях hPSC. Через шесть недель место трансплантата было визуализировано макроскопически, с образованием, похожим на глаза, в мышце. После удаления эксплантов под стереомикроскопом можно было идентифицировать как светлые сферические структуры.
У трансплантированных животных наблюдалось надёжное обнаружение положительных клеток с С-пептидом. Инсулино-окрашивание подтвердило наличие человеческих бета-подобных клеток внутри трансплантата. Были обнаружены клетки, положительные к глюкагону и соматостатину, что свидетельствует о сохранении популяций альфа- и дельта-клеток.
Этот протокол облегчает проведение in vivo функциональных анализов и оценки выживаемости и созревания трансплантированных человеческих трансплантатов. Самым важным аспектом является обеспечение высококачественной дифференцировки стволовых клеток и мягкое обращение с ними во время формирования кластеров для максимизации жизнеспособности и обеспечения хорошей выживаемости клеток. Эти модели облегчают изучение генетических механизмов, лежащих в основе дисфункции моногенного диабета и бета-клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье JoVE представлен подробный протокол внутримышечной трансплантации островков Лангерганса, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), иммунодефицитным мышам. Этот метод представляет собой менее инвазивную альтернативу трансплантации под капсулу почки или подкожно, обеспечивая простой хирургический доступ и надежное извлечение трансплантата. Протокол позволяет оценивать функцию островков с помощью анализа глюкозостимулированной секреции инсулина (GSIS) in vivo после перорального введения глюкозы, а также облегчает последующий гистологический анализ.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Регенеративная медицина
- Терапия стволовыми клетками
- Исследования диабета
Теоретические основы
- Эндокринные клетки поджелудочной железы, полученные из hPSC, перспективны для клеточной терапии диабета и моделирования заболеваний.
- Существующие места трансплантации, такие как капсула почки или подкожное пространство, имеют технические или физиологические ограничения.
- Для изучения созревания и функции островков, полученных из стволовых клеток, в физиологическом контексте часто требуется имплантация in vivo.
- Существует потребность в воспроизводимых и доступных местах трансплантации, позволяющих извлекать трансплантат и проводить функциональную оценку.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол внутримышечной трансплантации островков SC-islets, полученных из hPSC, иммунодефицитным мышам.
- Обеспечить возможность оценки приживаемости, выживаемости и функции островков в минимально инвазивном месте введения.
- Обеспечить функциональную оценку с помощью анализа GSIS in vivo и гистологического анализа после трансплантации.
- Создать воспроизводимую основу для доклинических исследований диабета с использованием островков, полученных из стволовых клеток.
Используемые методы
- Подготовка и уплотнение кластеров SC-островков поджелудочной железы, полученных из hPSC.
- Хирургическая операция по внутримышечной трансплантации иммунодефицитным мышам.
- Оценка секреции инсулина, стимулированной глюкозой (GSIS), in vivo после перорального введения глюкозы.
- Извлечение трансплантата и гистологический анализ для оценки после трансплантации.
Основные результаты
- Успешное приживление и выживание островков, полученных из hPSC, в месте внутримышечной трансплантации.
- Обнаружение функциональной секреции инсулина в ответ на глюкозную нагрузку с помощью GSIS in vivo.
- Надежное извлечение трансплантатов для гистологического анализа, подтверждающего структуру островков и экспрессию маркеров.
- Демонстрация воспроизводимого, минимально инвазивного метода для доклинических исследований трансплантации островков.
Выводы
- Внутримышечная трансплантация является жизнеспособным и доступным методом приживления островков, производных hPSC, у мышей.
- Данная процедура позволяет проводить функциональную оценку островков, полученных из стволовых клеток, с помощью анализа GSIS in vivo.
- Извлечение трансплантата позволяет провести комплексный гистологический и молекулярный анализ после трансплантации.
- Данный протокол представляет собой воспроизводимую доклиническую модель для развития исследований в области клеточной терапии диабета.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Внутримышечная трансплантация эндокринных клеток поджелудочной железы, полученных из плюрипотентных стволовых клеток человека, представляет собой малоинвазивную и воспроизводимую доклиническую модель для разработки методов клеточной терапии диабета. Данный подход позволяет провести функциональную оценку островков, полученных из стволовых клеток, посредством анализа секреции инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой in vivo, а также обеспечивает надежное извлечение трансплантата для последующего анализа, что решает основные проблемы, связанные с традиционными местами трансплантации. Этот метод повышает прогностическую достоверность доклинической оценки, создавая физиологические условия для созревания и функционирования островков, одновременно улучшая хирургическую доступность и снижая инвазивность процедур для животных.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем оценки функционального созревания островков, полученных из стволовых клеток, в физиологическом контексте.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет надежного приживления и глюкозозависимой секреции инсулина у иммунодефицитных мышей.
- Стратегическая ценность: повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней, обеспечивая воспроизводимые функциональные показатели до этапа оптимизации ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего скрининга соединений путем обеспечения функционального приживления островков.
- Операционная ценность: Стандартизация процедур трансплантации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости доклинических исследований.
- Стратегическая ценность: Повышение готовности анализа за счет получения количественных функциональных показателей с помощью GSIS in vivo для оценки эффекта соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Обеспечивает релевантность моделируемого заболевания за счет воспроизведения функции островков человека in vivo, что способствует согласованию трансляционных биомаркеров.
- Операционная ценность: Гарантирует непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации благодаря стандартизированному извлечению трансплантатов и гистологическому анализу.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения по продвижению проекта с учетом рисков, предоставляя функциональные и структурные данные о приживаемости и созревании островков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в процесс разработки новых лекарственных средств, обеспечивая проверку гипотез на ранних этапах поиска, позволяя стандартизировать анализы для скрининга и предоставляя функциональные данные, которые служат основанием для идентификации перспективных соединений-лидеров и принятия решений по переходу к доклиническим исследованиям.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигналов путем оценки функции островков в физиологическом месте трансплантации.
- Скрининг: повышает готовность анализа за счет стандартизированной трансплантации и воспроизводимых измерений секреции инсулина, стимулированной глюкозой.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимых переменных с помощью GSIS in vivo для сравнения функции трансплантата при различных условиях.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преклиническую преемственность, позволяя проводить гистологический и молекулярный анализ извлеченных трансплантатов для оценки их созревания.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую преклиническую платформу для итерационных циклов «проектирование-тестирование» при разработке терапии диабета на основе стволовых клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность за счет снижения механистической неопределенности в функциях и созревании островков, полученных из стволовых клеток.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость процедур трансплантации в различных исследовательских центрах.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go), предоставляя надежные функциональные данные, что снижает биологические риски на поздних этапах программ по борьбе с диабетом.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию с учетом рисков благодаря воспроизводимому приживлению и функциональной валидации островков, полученных из стволовых клеток.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области дифференцировки стволовых клеток, методов микрохирургической трансплантации и метаболического тестирования in vivo.
- Зависимость от стерильной хирургической инфраструктуры, систем проведения глюкозотолерантного теста и методов анализа инсулина для получения функциональных показателей.
- Необходима стандартизация взаимодействия между группами по обработке клеток, хирургическими и аналитическими группами для обеспечения воспроизводимости результатов.
- Требуется учет особенностей адаптации для различных линий иммунодефицитных мышей и сроков созревания островков.
- Ограничено необходимостью послеоперационного мониторинга и процедур извлечения трансплантата, что может повлиять на пропускную способность при крупномасштабных исследованиях.
