Процедуры идентификации ингибиторов входа SARS-CoV-2 как потенциальных противовирусных препаратов с использованием псевдовирусов на основе MLV

Наши исследования сосредоточены на выявлении ингибиторов, блокирующих проникновение SARS-CoV-2 с помощью псевдовирусных систем. Изучение проникновения SARS-CoV-2 часто требует лабораторий с высоким уровнем биобезопасности, обычно BSL-3. Этот протокол обеспечивает безопасный антивирусный скрининг, используемый в псевдовирусах в стандартных лабораториях BSL-2.

Для начала поместите пластину с культивированием тканей с шестью колодцями в шкаф биобезопасности и засейте семя 7,5 умножить на 10 на мощность пяти клеток, производных из HEK 293, на одну скважину в двух миллилитрах полной среды. Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа за ночь. На следующий день подтвердите, что совместимость клеток достигла примерно 50–60%.

На следующий день приготовьте полиэтилениминовый или раствор PEI, добавив пять микролитров по одному миллиграмму на миллилитр PEI в 50 микролитров восстановленной сывороточной среды в 1,5-миллилитровой микроцентрифугной трубке. В отдельной микроцентрифуге объёмом 1,5 миллилитра подготовьте раствор ДНК, добавив 2,5 микрограмма плазмиды, экспрессирующего GFP, в 50 микролитров той же среды. Перемешайте каждую трубку кратко с помощью вихря, затем опустите пять секунд вниз и инкубуйте при комнатной температуре.

В течение 10-минутного инкубационного периода аккуратно удалите среду из каждой ямы пластины шести лунок, не нарушая монослой клетки, и добавляйте в каждую скважину по одному миллилитру полной трансфекционной среды без антибиотиков. После инкубации добавьте 50 микролитров раствора ДНК в пробирку с раствором PEI. Быстро перемешивайте, пипетируя шесть раз, и инкубуйте при комнатной температуре ровно три минуты.

Затем быстро добавляйте комплекс ДНК PEI по каплям в соответствующую скважину. Теперь запечатайте края пластины парапленкой и центрифугой при 1000 G на 30 минут при комнатной температуре без разрыва с помощью поворотного ротора и ковша для пластин. После центрифугирования аккуратно удалите парапленку и инкубируете пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение трёх часов.

Затем аккуратно заменяйте трансфекционную среду в каждой колодце двумя миллилитрами предварительно тёплой полной DMEM-среды. Инкубировать трансфектированные клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 48 часов и оценить эффективность трансфекции, оценивая экспрессию GFP с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки, полученные из семени HEK 293T, в две пластины по 6 ямы, как было показано ранее.

Назначить одну пластину для генерации псевдовирусов шипов SARS-CoV-2, а другую — для псевдовирусов VSVG. Подготовьте смесь трансфекции и комплексы ДНК PEI в день эксперимента и инкубировать 10 минут при комнатной температуре. Во время инкубации аккуратно удаляйте среду из каждой из шести пластин, не нарушая монослой клетки.

Медленно добавляйте в каждую скважину по миллилитру предварительно нагретого полного трансфекционного материала без антибиотиков, позволяя среде стекать по стенке колодца. Добавьте подготовленные комплексы трансфекции к клеткам для трансфекции, как было показано ранее. После 48 часов инкубации после трансфекции соберите супернатанты из каждой колодцы в стерильную коническую трубку объемом 50 миллилитров и центрифугуйте при температуре 290 G в течение семи минут при четырёх градусах Цельсия.

Соберите безклеточный супернатант и профильтруйте его через стерильный фильтр с полвинилиденфторидом объёмом 0,45 микрометра. Подготовьте один миллилитр аликвотов фильтрованного супернатанта и храните их при минус 80 градусах Цельсия семена 2,5 раза 10 на мощности четырёх клеток HSI — высокочувствительной к SARS-CoV-2 клеточной линии в 50 микролитрах полного DMEM на скважину в 96-луночной пластине для культивирования тканей. Подготовьте и промаркируйте тройные колодцы для каждого состояния для тестирования, включая безискровную псевдовирусную инфекцию и неинфицированные контроли.

Инкубировать тарелку при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа за ночь. В день трансдукции разморозьте по одному аликвоту каждой партии псевдовируса на льду и аккуратно смешайте инверсией, включая одну аликвот безшипового контроля. Добавляйте необходимые объемы подготовки псевдовируса непосредственно в назначенные скважины.

Регулируйте объём каждой скважины до 150 микролитров при полном DMEM. Теперь запечатайте пластину парапленкой и центрифугой при 2 500 G на 45 минут при комнатной температуре без перерыва. Снимите уплотнение парапленки и инкубуйте пластину в течение 72 часов при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.

После инкубации подготовьте реагенты для анализа люциферазы согласно инструкциям производителя. Разморозьте субстрат люциферазы и 5-кратный буфер лизиса анализа люциферазы при комнатной температуре на 10–15 минут. Разведите буфер лизиса анализа люциферазы 5X до 1X стерильной водой.

Аккуратно аспирируйте и отбрасывайте супернатант. Далее добавьте 30 микролитров 1X лизис-буфера в каждую скважину. Поставьте тарелку на шейкер и встряхивайте 10 минут при 150 оборотах в минуту при комнатной температуре.

Проверьте полный лизис клеток под инвертированным микроскопом, чтобы убедиться, что клетки полностью лизированы и не различимы. Затем переложите лизаты на непрозрачную белую пластину с 96 лунками. Добавьте 50 микролитров субстрата люциферазы в каждую колодцу.

Немного перемешайте, аккуратно двигая пластину круговым движением, и поместите её в люминометр и измерьте люминесценцию. Семя 2,5 раза по 10 на мощность четырёх ячейок HSI в 50 микролитрах полного DMEM на одну скважину в пластине на 96 лунц, как было описано ранее. Инкубировать за ночь при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.

На следующий день подготовьте один-три последовательных разбавления соединений для тестирования, таких как арбидол в полном DMEM, содержащем 0,5% диметилсульфоксида. С помощью многоканальной пипетки аккуратно аспирируете среду из каждой ямы. Добавьте 50 микролитров соответствующего соединенного разбавления в каждую скважину, одновременно добавляя полный DMEM только в контрольные скважины 12 колонны.

Инкубировать в течение часа при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. Не удаляя соединения, напрямую добавляйте 50 микролитров псевдовируса SARS-CoV-2 в каждую разбавленную в полной среде с одинаковыми концентрациями соединений. Запечатайте пластину парпленкой.

Центрифуга при 2 500 г в течение 45 минут при комнатной температуре без перерыва. После удаления парфильма инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 72 часов. Наконец, измерите инфекционность с помощью анализа люциферазы, как было показано ранее.

Трансфекция клеток, полученных из HEK 293T, с разветвлённым PEI привела к высокой эффективности трансфекции и примерно 70% положительных клеток GFP. 48 часов после трансфекции. Заражение восприимчивых клеток HSI уменьшающимся количеством псевдовирусов SARS-CoV-2 или псевдовирусов VSVG показало дозозависимое увеличение люминесценции с увеличением входа псевдовируса.

Псевдовирусы и неинфицированные клетки показали очень низкий уровень люминесценции. Соединение арбидол было протестировано на способность ингибировать проникновение псевдовируса и обеспечивало чёткое подавление активности люциферазы в ответе на дозу, создаваемое шиповыми псевдовирусами, с меньшим торможением, наблюдаемым для псевдовирусов VSVG. Анализ показал Z-простой коэффициент 0,54, что указывает на пригодность для целей скрининга.

Обработка арбидолом в концентрациях, начинающихся с 30 микромоляров, не повлияла существенно на жизнеспособность клетки по сравнению с клетками, обработанными только носителем диметилсульфоксида. Этот протокол позволял создавать псевдовирусы с высоким титром при оптимальных условиях. Это позволяет исследователям измерять псевдовирусное проникновение и выявлять соединения, которые ингибируют инфекцию, опосредованную шипами SARS-CoV-2.

Высокая эффективность трансфекции критически важна для генерации псевдовирусов с высоким титром и получения надёжных сигналов заражения в последующих анализах. Эта система поддерживает высокопроизводительный антивирусный скрининг и обесценивание ингибиторов входа против новых вариантов SARS-CoV-2, а также может быть легко адаптирована для генерации псевдовирусов, демонстрирующих белки оболочки других вирусов.