Геномное картирование модификаций гистонов и сайтов связывания факторов транскрипции в нейроэндокринных мелкоклеточных линиях рака легких с помощью CUT&RUN

Цель нашего исследования — выявить взаимодействия между факторами, определяющими линию, и белками, ремоделирующими хроматин в различных типах мелкоклеточного рака лёгких, в регулировании транскрипционных ландшафтов и в том, как эти взаимодействия могут способствовать развитию заболеваний, включая инициацию и прогрессирование рака. Мы стремимся достичь этого, проводя эксперименты, такие как CUT&RUN — это метод секвенирования следующего поколения, который позволяет профилировать или идентифицировать в глобальном масштабе геномные места, где эти дифференциально модифицированные гистоны и факторы транскрипции с ДНК связаны. В конечном итоге мы надеемся выявить новые пути, которые эпигенетически регулируются и могут быть терапевтически применимы для разработки новых методов лечения пациентов с этой очень агрессивной формой рака лёгких.

Для начала удалите культивированные мелкоклеточные нейроэндокринные клетки рака лёгких из инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия и изучите их под микроскопом, чтобы убедиться в их качестве. Затем перенесите суспензию ячейки в коническую трубку объёмом 50 миллилитров и центрифугуйте трубку при 1 200 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Аспирируйте среду из конической трубки, используя вакуум в капюшоне, и промывайте полученную клеточную гранулу 20 миллилитрами PBS.

Центрифугуйте трубку снова при 1 200 г в течение пяти минут и аспирируйте PBS. Добавьте Аккутазу в зависимости от размера гранул и инкубируемые в течение трёх-пяти минут при 37 градусах Цельсия, чтобы переварить клеточную гранулу. Далее прекратите пищеварение, добавив пять миллилитров PBS с 10% FBS и смешивая для получения суспензии в одной клеточке.

После повторного центрифугирования клеток, как было показано ранее, взвешивают гранулу в пяти миллилитрах PBS. Подсчитайте стартовые ячейки и подтвердите их жизнеспособность и целостность с помощью автоматического счётчика ячеек. Рассчитайте общее количество требуемых ячеек и добавьте 20% излишка, чтобы учесть ошибки пипетирования.

Перенесите рассчитанное общее количество ячеек в трубки объёмом 1,5 миллилитра и центрифугуйте трубки при 600 г в течение трёх минут при комнатной температуре. Ресуспензировать ячейки в буфере промывания при плотности пять умножить на 10 при мощности пяти ячеек за реакцию, всего шесть реакций. Используйте 100 микролитров буфера за каждую реакцию и аккуратно, но тщательно обрабатывайте пипеткой, чтобы обеспечить равномерное подвешение.

Центрифугуйте клетки снова, удалите супернатант и повторите промывку. Аликвот 100 микролитров промытых клеток в каждую тюбик восьмиполосного комплекта, содержащего 10 микролитров активированных шариков Concanavalin A. Аккуратно перемешайте содержимое пипеткой.

Инкубировать шлам из клеток шарика в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы клетка связалась с шариками, и быстро вращать трубки в мини-центрифуге, чтобы собрать суспензию, не давая шарикам осеть. Поставьте трубки на магнитную стойку объемом 0,2 миллилитра. Дайте суспензии очиститься, а супернатант — пипеткой.

Затем снимите трубки с магнита. Немедленно добавьте 50 микролитров буфера ледяных антител к каждой реакции и аккуратно пипеткой, чтобы подвесить бусины. Правильно маркируйте восемь трубок с полосой.

Добавляйте по 0,5 микрограмма антител к H3K4me3, H3K4me1 и иммуноглобулину G, а также по 0,6 микрограмма поликлональных антител E2F7 из разных источников в каждую пробирку реакции. Аккуратно перемешайте содержимое каждой реакционной трубки пипеткой, и инкубуйте их ночью на нутаторе при температуре 4 градуса Цельсия с поднятыми крышками трубок. Вынимите восемь трубок из нутатора и быстро вращуйтесь, чтобы собрать жидкость на дне каждой трубки.

Теперь поставьте трубки на магнитную стойку, пока суспензия не рассеится. Затем аккуратно пипеткой, чтобы удалить и выбросить супернатант. Держа трубки на магнитной подставке, промывайте каждую трубку дважды с помощью 200 микролитров буфера для проницаемости холодных элементов и используйте многоканальную пипетку для удаления супернатанта после каждой мойки.

Далее снимите трубки с магнитной стойки. Сразу же добавьте 50 микролитров холодно-пропускного буфера в каждую реакцию и аккуратно пипеткойте, чтобы снова суспензировать клетки и шарики. Затем добавьте 2,5 микролитра нуклеазы белка AG-микрококка в каждую реакцию и хорошо перемешайте, аккуратно пипетируйте.

После 10-минутной инкубации при комнатной температуре выполните быстрое вращение трубок. Положите их обратно на магнитную стойку, пока суспензия не прояснится, а затем удалите супернатант. После дважной промывки буфером проницаемости холодных клеток аккуратно подвесьте их в 50 микролитрах проницаемого буфера клетки.

Держа трубки на льду, добавляйте по одному микролитру 100-миллимолярного хлорида кальция в каждую реакцию в восьмитрубочной полосе предыдущего этапа. Аккуратно пипетить, чтобы полностью подвесить бусины и способствовать эффективному пищеварению. Инкубировать трубки на нутаторе при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов, поддерживая колпачки трубок поднятыми на протяжении всей инкубации.

Теперь в новой трубке объёмом 1,5 миллилитра приготовьте смесь стоп-буфера, смешав 33 микролитра стоп-буфера с одним микролитром спайка escherichia coli в ДНК при 0,5 нанограммах за реакцию. Аккуратно перемешайте раствор. В конце двухчасовой инкубации добавьте в каждую реакционную трубку 33 микролитра готовой буферной смеси стопа и тщательно перемешайте.

Инкубировать реакционные трубки в термоциклере при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. После быстрого вращения поместите трубки на магнитную стойку, пока раствор не станет прозрачным. Аккуратно перенесите примерно 85 микролитров супернатанта, содержащего ДНК высвобождения CUT&RUN, в свежие пробирки объемом 1,5 миллилитра.

Очистить восстановленную ДНК, оценить её количество и провести распределение размера фрагментов для контроля качества. Затем приступайте к подготовке библиотек CUT&RUN, количественной оценке, пулированию индексируемых библиотек и парному секвенированию следующего поколения. Высококлеточные линии с гомологом Achaete-scute-1, DMS79 и H146, а также с нейрогенным фактором дифференцировки 1 с высоким уровнем клеток, H82 выросли как неадгезентные агрегаты или компактные сфероиды в суспензии, тогда как H446 отличался смешанной морфологией: примерно 80% внутренних клеток и 20% в суспензии.

Анализ фрагментов ДНК CUT&RUN показал, что энхансер гистон H3K4me1 дал наибольшее количество ДНК во всех клеточных линиях, за ним следовали H3K4me3, при этом E2F7 и IgG — самые низкие показатели. Для экстракции CUT&RUN ДНК распределение размеров фрагментов для H3K4me1 и H3K4me3 показало чёткие пики для мононуклеосом, ди-нуклеосом, а также геномной ДНК. В отличие от этого, для E2F7 или контроля IgG чётких пиков не было обнаружено.

Несмотря на низкий вход ДНК, библиотеки секвенирования следующего поколения были успешно созданы для всех целей CUT&RUN, включая E2F7 и IgG. Анализ тепловой карты в мутантных клетках дикого типа DMS79 и гетерозиготных H146 показал, что сигналы H3K4me3 и E2F7 были обогащены вблизи стартовых мест транскрипции, тогда как сигналы H3K4me1 были более широко распределены. Визуализация браузера генома в случайно выбранной области хроматина показала чёткие пики для H3K4me3, H3K4me1 и E2F7, тогда как IgG не показал обогащения.

Поэтому традиционно учёные и исследователи использовали иммунопреципитацию хроматина, а затем секвенирование или ChIP-seq для решения подобных вопросов, которые мы задаём. Однако ChIP-seq требует довольно большого количества входных материалов, что не всегда возможно в зависимости от используемой модели. CUT&RUN, напротив, требует значительно меньше входных материалов — всего 50 000 ячеек, и требует меньше высокопроизводительных чтений секвенирования, что делает его дешевле и обеспечивает гораздо меньше фона при генерации данных.

CUT&RUN — это техника, которую можно применять не только к клеткам в 2D-культуре, но и адаптировать для других доклинических моделей, таких как органоиды, полученные пациентами, и ксенотрансплантаты. Его также можно использовать для профилирования хроматинового ландшафта в тканях, включая как нормальные, так и заболевшие ткани. Это чрезвычайно полезная технология или техника для исследователей рака, но также может быть очень полезна и для неонкологов, специализирующихся на изучении различных человеческих заболеваний.

Этот протокол позволяет картировать модификации гистонов и сохраняющиеся профили различных белков in situ в клеточном геноме. Предоставление PTM гистонов и связывания TF между подтипами SCLC может выявить специфические подтипы генов и регуляторные элементы, такие как энхансеры и супер-усилители.