Валидация гипербарической системы давления с помощью ксеноновой анестезии для Drosophila melanogaster
20 февраля 2026 г.
Газы, которые кажутся безвредными при атмосферном давлении, могут вызывать такие явления, как наркоз, в гипербарических условиях. Обычные гипербарические камеры давления дорогостоящие и трудоёмкие. В данном исследовании представлен простой и недорогой метод изучения влияния ксенона на Drosophila melanogaster при умеренных давлениях ниже 4 атм.
Мои исследования направлены на понимание того, как работает общий наркоз, и существует несколько газов, которые являются анестетиками при гипербарических условиях. Этот протокол позволяет нам анестезировать плодовых мушек ксеноном для изучения основного механизма общей анестезии. Для начала для каждого эксперимента соберите 20 анестезиированных самок и самцов дрозофилы меланогастер возрастом от одного до трёх дней и дайте им отдохнуть в флаконе с едой не менее 24 часов перед экспериментом при температуре около 22 градусов Цельсия.
Переместить газы из их контейнерных газовых баллонов в герметичные газовые мешки для экспериментального использования. Используя силиконовую трубку, напрямую подключите выход газового баллона к входу газового мешка для пропуска газа. Прикрепите силиконовую трубку длиной 25 миллиметров к полипропиленовому шприцу.
Подключите полипропиленовый шприц к газовым мешкам и к трёхстороннему крану. Чтобы собрать гипербарическую систему, сначала разместите светодиодный стол в горизонтальном положении на столе. Разместите инъекционный насос рядом с короткой стороной светодиодного стола, направленный так, чтобы экспериментальный шприц при установке выходил над подсветкой.
Теперь вырежьте силиконовую трубку длиной 75 миллиметров. Подключите трёхсторонний отвод к манометру с помощью силиконовой трубки от центрального сопла. Используйте пружинные зажимы на сопле со стороны манометра и трёхпозиционный отвод сверху, чтобы убедиться, что трубка плотно закреплена.
Затем используйте кнопку с двойной стрелкой на блоке управления насосом впрыски, чтобы установить скорость 80 миллиметров в минуту и длительность 38 секунд для автоматического сжатия или декомпрессии поршня. Далее ограничьте окружающий свет в экспериментальной комнате и включите светодиодный стол. Установите уровень яркости на три для увеличения контраста видео.
Снимите поршень из поликарбонатного шприца. Вставьте небольшое количество хлопка в кончик шприца, чтобы предотвратить уход мух. Чтобы перенести 40 мух в поликарбонатный шприц, снимите крышку флакона, поставьте ствол сверху на флакон, переверните сборку и постучите, чтобы переместить мухи в ствол.
Ориентируйте шприц так, чтобы отметки ствола были обращены к камере для оптимального визуализации мушок. Закрепите шприц, закрепив и ствол, и головку поршня к насосу с помощью регулируемых винтов. Теперь уберите хлопок с наконечника шприца и подключите шприц к трёхстороннему крану.
Начинайте запись видео. Включите манометр, затем поверните стоп, чтобы соединить манометр с шприцом, и подтвердите нулевое давление килопаскаль. Поверните трёхсторонний отвод в боковое положение, чтобы обеспечить обмен воздухом с помощью шприца.
Используя ручное управление насосом впрыски, переместите поршень с отметки 20 миллилитров на два миллилитра. Аспирировать 18 миллилитров анестетика из газового мешка в полипропиленовый шприц. Подключите шприц к боковому порту приманки трёхстороннего крана.
Затем используйте ручной вариант впрыска насоса, чтобы вернуть поршень на отметку 20 миллилитров. Поверните стоп, чтобы подключить манометр к шприцу, и посмотрите на показания давления. Запустите автоматическое движение поршня с заранее установленными настройками скорости и длительности.
Дайте поршню достичь отметки в пять миллилитров в течение 38 секунд, контролируя давление. Оставьте поршень в положении 5 миллилитров на 20 секунд и отмените максимальное давление. Аккуратно постучите по шприцу, чтобы убрать мухи, прилипшие к поршню, и дайте им осесть на дне.
Запускайте автоматическую декомпрессию через 20 секунд. Завершите эксперимент, когда поршень вернётся к отметке 20 миллилитров, и запишите окончательное давление для контроля утечки. Запустите ScreenFlow для редактирования видео.
Обрезайте каждое записанное видео в область, соответствующую первым пяти миллилитрам ствола шприца. Обрежайте каждое видео до первых 20 секунд после декомпрессии шприца. Экспортируйте видео в виде GIF и дублируйте их.
Теперь запустите программное обеспечение Fiji, чтобы удалить первый и последний кадры из разных дубликатов. Последовательно кликайте по изображению, видеомонтажу и удаляйте кадры. Нажмите на process, binary и сделайте двоичный файл для каждого GIF-файла двоичным, чтобы мухи выглядели белыми на чёрном фоне.
Откройте оба бинарных файла на Фиджи. Вычислите разницу пикселей между ними, выбрав процесс и калькулятор изображения, чтобы сгенерировать файл разницы пикселей. После сохранения файла разницы пикселей выберите анализ и анализ частиц, регулируя пороги размера пикселей для улучшения отношения сигнал/шум.
Сохраняйте сгенерированный CSV-файл с разницей пикселей на кадр. Используйте данные для расчёта кумулятивного движения между кадрами для статистического сравнения. Экспериментальные видео обрабатывались путём преобразования их в бинарные и разные изображения для подготовки к анализу пикселей.
Без порогового значения различия пикселей накапливались на протяжении кадров и повышали базовый сигнал примерно до 20 000. Применение порога размера пикселей от 100 до 1000 снижало фоновый сигнал и подчеркивало различия, вызванные движением мух. Значения разницы пикселей на кадр оставались близкими к нулю до 200-го кадра.
Модель YOLOv11 N отслеживала мух с высокой точностью на кадр, но частые окклюзии приводили к чрезмерному назначение идентификации мух. Из-за несоответствий в отслеживании движение мух количественно оценивалось путём суммирования всех движений ID за эксперимент и нормализации максимум на 200 ID. Мухи, подвергшиеся воздействию 85%ксенона, восстанавливались быстрее и двигались больше, чем те, кто подвергся воздействию 90% или 95%ксенона.
Наш протокол обеспечивает простоту и скорость, а также использует более дешёвые материалы, чем традиционные камеры давления. Максимальное давление ограничено примерно четырьмя атмосферами, а несовершенное уплотнение приводит к постепенной потере давления. Такая система позволяет воспроизводимо измерять влияние анестетического газа на поведение малых модельных организмов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Overview
This article presents a streamlined experimental protocol for studying the effects of xenon anesthesia on Drosophila melanogaster under hyperbaric conditions. The setup enables precise behavioral analysis of fruit flies exposed to elevated gas pressures, facilitating research into the mechanisms of general anesthesia and narcosis in small model organisms.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Behavioral pharmacology
- Experimental physiology
Background
- Hyperbaric conditions can alter animal behavior due to increased ambient gas concentrations.
- General anesthesia and narcosis induced by gases remain incompletely understood, especially at the cognitive and behavioral levels.
- Xenon is a noble gas and a safe anesthetic in humans but does not anesthetize flies at normal atmospheric pressure.
- There is a need for accessible methods to study gas-induced anesthesia in model organisms.
Purpose of Study
- To develop a simple, cost-effective setup for inducing and analyzing xenon anesthesia in Drosophila melanogaster under hyperbaric conditions.
- To enable reproducible behavioral measurements of anesthetic gas effects in small animals.
- To facilitate further studies of other gases and their behavioral impacts under increased pressure.
Methods Used
- Preparation of 1–3 day old male and female flies, rested for 24 hours before experiments.
- Transfer of gases from cylinders to leak-proof bags, and controlled delivery into a polycarbonate syringe using silicone tubing and a three-way tap.
- Assembly of a hyperbaric setup with an LED light table, injection pump, manometer, and video recording system.
- Behavioral monitoring of flies during compression and decompression cycles, followed by video analysis using Fiji software and YOLOv11 N model for movement quantification.
Main Results
- The protocol allows reliable induction of xenon anesthesia in flies at pressures up to ~3–4 atm.
- Behavioral recovery and movement were inversely related to xenon concentration: flies exposed to 85% xenon recovered faster and moved more than those exposed to 90% or 95% xenon.
- Image processing and pixel difference analysis provided quantitative measures of fly movement post-anesthesia.
- The setup is simpler, faster, and less expensive than traditional pressure chambers, though limited by maximum pressure and gradual pressure loss.
Conclusions
- This protocol enables efficient and reproducible behavioral studies of anesthetic gases in Drosophila under hyperbaric conditions.
- It provides a valuable tool for investigating the mechanisms of general anesthesia and narcosis in model organisms.
- The approach can be adapted for studying other gases and their effects on animal behavior under increased pressure.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative behavioral analysis of anesthetic effects in Drosophila melanogaster under hyperbaric conditions addresses a critical gap in early-stage neuropharmacology and target validation. This protocol enables reproducible, scalable assessment of gas-induced cognitive and motor changes, supporting mechanistic de-risking and predictive confidence in CNS drug discovery. The approach offers a cost-effective, adaptable platform for evaluating anesthetic mechanisms and cross-species translational relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of anesthetic mechanisms in a genetically tractable model organism.
- Supports functional target validation by quantifying behavioral endpoints under controlled gas exposures.
- Facilitates mechanistic de-risking for CNS-active compounds through direct observation of cognitive and motor responses.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible system for behavioral phenotyping under variable gas concentrations and pressures.
- Generates quantitative movement data suitable for downstream screening and comparative analysis.
- Enables assay scalability and platform reuse for diverse gas or compound evaluations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral endpoints in Drosophila with translational biomarker strategies for CNS drug development.
- Supports continuity from early discovery through preclinical validation by enabling cross-condition comparisons.
- Offers predictive value for anesthetic and neuroactive compound effects in higher organisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical behavioral validation, providing a bridge between in vitro assays and mammalian models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on anesthetic action and neural circuit involvement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative behavioral outputs for compound or gas evaluation.
- Analytics: Employs image-based movement quantification and statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment of fly behavioral data with mammalian endpoints for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Adaptable for multiple gases and experimental paradigms, enhancing platform value across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes behavioral assays with scalable, cost-effective instrumentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in early CNS portfolio development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive compounds and anesthetic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in behavioral pharmacology and quantitative image analysis.
- Needs basic instrumentation: pressure system, video capture, and image processing software.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other small model organisms with protocol modifications.
- Maximum pressure and sealing limitations may constrain certain experimental designs.
