Локализованные RNAi и эктопической экспрессии гена в медицинской пиявки

Медицинская пиявка является полезной модельной системой для нейробиологических исследований благодаря своей простоте, доступности и возможности статически идентифицировать нейроны с применением множества различных экспериментальных инструментов на этапах от раннего эмбриогенеза до глубокой старости. Особенно перспективным использованием эмбриона пиявки являются исследования методом таймлапс-визуализации роста нейритов в живом неповрежденном животном после очень точной модификации экспрессии генов в изучаемом нейроне или его мишенях. В данном видео мы демонстрируем новую технологию быстрого, точного и высоколокализованного введения реагентов во внутренние слои живых эмбрионов пиявки с помощью пневматического капиллярного пистолета, разработанного в сотрудничестве между лабораторией Алекса Гроссмана и нашей лабораторией.

Хотя данный метод может быть применен для доставки двухцепочечной РНК ДНК или любой другой молекулы, которую можно закрепить на микроскопических золотых частицах, мы будем использовать его как для нокдауна, так и для нокина молекулы наведения аксонов Rin. Здравствуйте, я из лаборатории Эдуардо Ано на факультете биологических наук Калифорнийского университета в Сан-Диего. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру нокдауна или нокина экспрессии молекулы наведения аксонов networking, которая естественным образом экспрессируется в вентральной стенке тела, но не в дорсальном домене всех сегментов тела пиявки.

Мы будем вводить молекулы двухцепочечной РНК или плазмидной ДНК в стенку тела и ганглии выбранных сегментов на ранних стадиях развития. Точечное введение с помощью пневматического капиллярного пистолета особенно важно, поскольку оно позволяет нарушать паттерны экспрессии генов в выбранных областях субсегмента, оставляя необработанные сегменты в качестве внутреннего контроля. Кроме того, этот метод позволяет достигать внутренних слоев клеток на ранних стадиях развития без повреждения тканей и без вскрытия образца.

Наконец, холистическая доставка обладает преимуществом возможности воздействия на ограниченное число клеток в выбранном месте, что является промежуточным вариантом между нокдауном в отдельной клетке с помощью микроинъекций и системным нокдауном с использованием генетических подходов. Итак, приступим. Медицинский моллюск LE давно используется для изучения свойств нервных клеток и связанных с поведением нейронных цепей благодаря простоте центральной нервной системы, состоящей примерно из 200 билатеральных пар нейронов и небольшого набора гигантских глий.

Каждый сегментарный ганглий из 21 сегмента тела, а также каждый нейрон пиявки могут быть многократно идентифицированы и изучены у разных особей — от ранней стадии эмбриона до взрослого организма. Со времен фараонов пиявки используются для кровопускания, и их постоянное применение в медицине делает их легкодоступными через коммерческих поставщиков животных. Однако, поскольку мы изучаем развитие нервной системы, в нашей лаборатории содержится живая колония из нескольких сотен пиявок, что обеспечивает нас постоянным запасом эмбрионов для экспериментов.

Пиявки являются гермафродитами. Они обладают как женскими, так и мужскими репродуктивными структурами и перекрестно оплодотворяются. Следовательно, все особи способны откладывать яйца.

Они создают структуру, называемую коконом, которую производят сами с помощью набора специальных желез, секретирующих весьма интересные полимеры в области тела, известной как клоака. Пиявка, когда она готова отложить яйца, зарывается в мох, который мы предоставляем в аквариумах, и начинает формировать вокруг своего тела кокон яйцевидной формы. Когда выделено достаточное количество материала и молекулы начинают полимеризоваться, пиявка откладывает яйца, а также питательный желток внутрь кокона, после чего выкарабкивается из него. С помощью лезвия бритвы мы можем извлечь эмбрионы, прорезав «окно» в конце кокона.

Как правило, в каждом коконе содержится от 10 до 20 эмбрионов, начиная примерно с шестого дня после начала их дифференцировки. Эмбрионы можно извлечь из кокона и выращивать в прудовой воде. Именно на этих стадиях мы обычно начинаем экспериментальные исследования развития нейронов.

Первым основным этапом данной процедуры является подготовка покрытых частиц. В этом демонстрационном видео мы покажем, как вводить в эмбрионы lech частицы золота, покрытые двухцепочечными молекулами РНК гомолога lech молекулы наведения аксонов rin. Целевыми клетками являются вентральные продольные мышечные клетки стенки тела, которые, как известно, экспрессируют и высвобождают Rin, начиная с ранних стадий эмбриогенеза.

Наша цель — максимально рано в процессе развития подавить естественную экспрессию в одном сегменте тела и пронаблюдать, как это влияет на категоризацию нейронов, чувствительных к данному важному фактору развития. Для этого этапа понадобятся ультразвуковая баня, вортекс, настольная центрифуга и ведро со льдом. Также необходим 100% изопропанол, который следует охладить на льду перед использованием.

Начните со 100 µL буфера для связывания, содержащего 50 mg/mL частиц vault. Данные частицы предназначены для РНК-интерференции и произведены компанией chell. Затем разбавьте раствор частиц, добавив 100 µL буфера для связывания, кратковременно перемешайте на вортексе и подвергните соникации в течение одной-двух минут, чтобы разделить частицы, которые могли слипнуться.

После двухминутного перемешивания добавьте от 5 до 10 мкг двухцепочечной РНК к частицам, перемешайте на вортексе и оставьте при комнатной температуре на две минуты. По истечении двух минут центрифугируйте комплексы двухцепочечной РНК и частиц при минимальной скорости 2 500 об/мин в микроцентрифуге в течение примерно 15 секунд.

Чтобы получить осадок, удалите супернатант и добавьте 750 µL изопропанола, стараясь минимально потревожить осадок. Кратковременно центрифугируйте в микроцентрифуге и после центрифугирования удалите супернатант, затем суспендируйте частицы золота в 100% холодном изопропаноле с помощью соникации. Для разделения частиц достаточно двух-трех коротких импульсов в ультразвуковой бане.

Вылейте раствор на предметное стекло и дайте растворителю полностью испариться. Наилучшие результаты достигаются, когда частицы покрывают непосредственно перед их введением в ткань; мы покажем, как это сделать, на следующем этапе. Перед проведением истической трансфекции ознакомимся с экспериментальной установкой и способом ее подготовки.

Пневматический капиллярный инжектор установлен на микроманипуляторе для точного введения частиц в эмбрионы. Поверхность эмбриона визуализируется с помощью видеомикроскопа. Полупроводниковый лазер генерирует луч света, направленный через внутренний капилляр инжектора, который используется для прицеливания по целевой ткани.

Отдельные линии из трубок Titan, подключенные к трем входам головки пистолета, подают гелий под давлением из одного источника. Одна линия всегда открыта, что обеспечивает непрерывный поток газа гелия через пистолет. Две другие линии обычно закрыты электромагнитным клапаном и содержат частицы золота с двумя различными покрытиями, которые были загружены в трубку.

В виде сухого порошка. Внешний капилляр пистолета подключен к вакуумной системе с избыточным давлением -12.5 PSI. Давление в головке варьируют в диапазоне от 10 до 15 PSI для достижения желаемой глубины проникновения частиц.

Давление гелия в головке может существенно влиять на глубину проникновения частиц, так же как и расстояние от эмбриона до пушки. Диаметр сопла, который различается у разных генных пушек, должен быть тщательно подобран в соответствии с площадью мишени. Теперь, когда мы продемонстрировали нашу экспериментальную установку, давайте загрузим нашу пушку Jing и произведем обстрел эмбрионов рыб-леч.

Перед заполнением трубки Titan крайне важно, чтобы частицы золота с покрытием были полностью сухими. Сначала частицы золота с покрытием счищают со стеклянных предметных slides с помощью покровного стекла или лезвия бритвы, после чего они готовы к загрузке в сложенный лист сывороточной бумаги. Трубку следует согнуть в форме буквы U рядом с коннектором, чтобы при загрузке частицы не распределялись по всей длине трубки, а сконцентрировались рядом с коннектором.

Соберите частицы небольшим шпателем или V-образным кусочком взвешивающей бумаги и заполните трубку. Во время заполнения постукивайте по трубке пальцем, чтобы равномерно распределить частицы. После заполнения трубки можно приступать к доставке двухцепочечной РНК с помощью пистолета Jing, но сначала необходимо подготовить пиявок.

Здесь представлены эмбрионы пиявок, возраст которых составляет примерно 10 дней. В настоящее время они находятся в стерильной среде, в которой будут содержаться как до, так и после введения двухцепочечной РНК. Первым этапом подготовки экспериментальных эмбрионов к введению двухцепочечной РНК является нанесение раствора 8% этанола в стерильной среде на плоский фрагмент гибкого силикона с V-образным желобом.

Один эмбрион добавляют и помещают вентральной стороной вверх непосредственно перед обстрелом частицами. Уровень среды в камере понижают так, чтобы она находилась чуть ниже верхней поверхности эмбриона, и сверху на него кладут кусочек бумажной салфетки с небольшим отверстием посередине для стабилизации и предотвращения высыхания поверхности, при этом открывая только ту область, которая будет целью на используемой сегодня стадии развития эмбриона. На стадии E 10 продольные мышечные клетки могут находиться на расстоянии примерно 10–20 мкм от внешней поверхности, глубже эпидермиса, дермы и круговых мышц.

В отличие от мышечных клеток, центральные ганглии на вентральной стороне эмбрионов на стадиях развития от E7 до E12 расположены примерно в 50 мкм от вентральной поверхности тела. Мы отрегулируем давление гелия таким образом, чтобы воздействовать на продольные мышцы, которые находятся на меньшей глубине, чем ганглии. Теперь мы готовы к обстрелу продольных мышц золотыми частицами.

Порции золотых частиц весом около 0,5 мг обычно хватает на 10 выстрелов, при этом за один выстрел обычно доставляется несколько сотен частиц. Выстрел осуществляется путем кратковременного открытия одного из клапанов на 0,3 секунды, что приводит к впрыску болюса частиц из соответствующей трубки в ствол пистолета. Для охвата интересующей области ткани часто требуется несколько выстрелов.

Трубку осторожно постукивают между выстрелами, чтобы выбить частицы и облегчить их впрыскивание в непрерывный поток гелия в канале пистолета. Если в рамках одного анализа требуется ввести второй реагент, можно загрузить другие частицы во вторую трубку сразу после введения золотых частиц. Эмбрионы возвращают в искусственную прудовую воду, желательно по одному эмбриону на чашку, на срок от одного до трех дней, пока воздействие RNAi или эктопическая экспрессия не будут признаны достаточными.

В течение этого времени эмбрионы содержат в темной камере при комнатной температуре. Перед вами пример анализа с использованием гибридизации in situ для определения экспрессии narine при нокдауне Mr.NA. Видно, что в обработанном эмбрионе лишь немногие мышечные клетки экспрессируют terrin.

Эти мышцы содержат частицы. Видно, что при покрытии частиц двухцепочечной РНК против narin наблюдается отчетливое подавление экспрессии narin, которое происходило только в клетках, содержащих частицы, обычно от одной до двух частиц на клетку. При покрытии частиц плазмидой, кодирующей GFP, в нейронах появляется флуоресценция, когда частицы попадают в их ядра при использовании применяемого нами пневматического капиллярного пистолета.

В данной демонстрации нам удалось доставить обе частицы в клетки в небольшом локализованном объеме живого эмбриона, не вызывая заметного повреждения клеток в целевой области. Мы также показали, что использование переносного капиллярного пистолета обеспечивает комплексный метод доставки и предоставляет новую возможность осуществлять нокаут и нокдаун генов в микроскопической области ткани, ограниченной в трех измерениях и нацеленной с высокой точностью без detectable повреждения ткани. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.