Микробный анализ ДНК в полевых условиях с использованием биологического набора для экстракции и полевой qPCR установки

Область наших исследований действительно включает проведение молекулярного анализа, который мы можем использовать для характеристики микробов, участвующих в рекультивации, добыче, профилактике коррозии, и действительно помогает нам отвечать на вопросы об устойчивом развитии. Это исследование устраняет ряд пробелов в исследованиях и доступности с помощью надёжных и удобных для практики молекулярно-биологических рабочих процессов, которые просты в использовании. Откройте крышку с обоих концов фильтра и подключите трёхмиллилитровый шприц, наполненный воздухом, с помощью фиксирующего соединения Luer.

Протолкните воздух, чтобы вывести остаточную воду. Отсоедините шприц и втяните больше воздуха, прежде чем повторить процесс. Затем повторите красную крышку розетки.

Переверните раствор в шприце для смешивания. Снимите крышку блокировочного шприца Luer и подключите шприц Solution A к инкапсулированному входу фильтра диаметром 0,2 микрометра через наконечник блокировки Luer. Нажмите на поршень, чтобы медленно добавить раствор A. Затем энергично встряхните закрытый фильтр рукой в течение пяти минут.

Теперь несколько раз переверните шприц Solution B, чтобы смешать. Снимите крышку Luer и подключите шприц к входу с капсулированным фильтром через наконечник Luer. После того как закрываете крышку впускного фильтра, энергично встряхивайте закрытый фильтр в течение пяти минут.

Снимите впускную крышку и переверните фильтр. Используйте трёхмиллилитровый шприц, прикреплённый к капсулированному фильтру, чтобы ввести в фильтр один миллилитр воздуха. Затем оттяните поршень, чтобы удалить весь лизат.

Переложите лизат в пятимиллилитровую бусиночную трубку. После запечатывания парапленкой энергично встряхните трубку в течение пяти минут, прежде чем поставить её вертикально. Поставьте картридж для подготовки образца на ровную поверхность и прикрепите замок Luer к шприцу объемом один миллилитр.

Используйте заострённый кончик колонки, чтобы проколоть два отверстия в первой части картриджа для подготовки образцов. Пипетте один миллилитр лизата из трубки в недавно пробитое отверстие первой части картриджа. Вставьте колонку шприца обратно в красную часть картриджа.

Затем полностью втяните жидкость в шприц и вытолкните её 10 раз. Теперь разместите острый кончик колонки шприца над красно-оранжевым участком и проколите два отверстия через фольгированный барьер. Используя поршень, втяните весь объём жидкости в шприц и полностью выпустите жидкость обратно.

Аналогично, используйте колонку шприца для прокола и прокачки оранжевых, жёлтых, синих, сухих на воздухе и зелёных секций, вытягивая и толкая поршень столько раз, сколько раз указано на секции. Затем используйте один миллилитровый шприц и столбец для подготовки образцов, чтобы пересадить весь раствор из зелёного участка в хорошо маркированную микропробирку объемом один миллилитр. Поместите до трёх экстракционных образцов ДНК в чистые лотки на полевых qPCR-инструментах, обеспечив один образец на определённый участок.

Поместите пробиральные полоски для каждого образца в соответствующие слоты A, B или C на лотке, выровняя первую яску каждой полоски с первой на лотке. Разблокируйте телефон и откройте приложение, названное в честь товарного знака инструмента qPCR. Когда приложение откроется, нажмите кнопку Start Run.

На следующем экране нажмите кнопку Generate IDs. Введите информацию о образце, нажав на Sample ID и введя название образца. Нажмите на блоки образца и выберите соответствующую единицу, затем нажмите под объём образцы и введите объём, используемый при извлечении.

После ввода информации по всем образцам нажмите кнопку «Продолжить». На следующем экране нажмите на значок папки, затем нажмите «Сохранить в текущую папку». Введите название серии и нажмите «Подтвердить».

Включите прибор, нажав и удерживая кнопку питания, пока все передние фары не загораются. Нажмите «Подтвердить» в заявке, чтобы продолжить. Нажмите Connect через интегрированную короткодействующую беспроводную связь в приложении.

Нажмите на встроенную кнопку короткого радиуса беспроводной связи на приборе, пока не мигает синий свет. Затем нажмите Подтвердить и выберите имя инструмента для подключения. Снимите крышки из пробирок для первого образца.

Добавьте 18 микролитров стерильной воды в каждую скважину и аккуратно пипеткой, чтобы растворить гранулу. Добавьте по два микролитра образца в каждую скважину и запечатайте пробирки резиновой полоской, чтобы обеспечить правильную ориентацию. Нажмите «Подтвердить» в приложении, когда все полоски готовы.

Удалите каждую пробирную полоску. Проверьте наличие пузырьков на дне скважин, затем аккуратно покачивайте полосу, пока они не поднимутся. Нажмите «Подтвердить», чтобы продолжить.

Откройте крышку прибора и вставьте пробирные полоски в прибор в правильном порядке и ориентации. Закройте крышку, пока она не зафиксируется, и нажмите «Подтвердить». Нажмите кнопку Start Run в приложении, чтобы начать запуск.

Когда забег закончится, нажмите Email Results. После подключения к беспроводному интернету нажмите «Отправить снова», чтобы передать результаты. Тщательно очищайте лоток между пробегами, чтобы предотвратить загрязнение.

Успешное завершение изоляции ДНК с использованием биологического набора для экстракции было подтверждено согласованными результатами qPCR по сравнению с валидированным лабораторным методом. Стандартное разбавление в культуре Dehalococcoides, проанализированное с помощью полевой qPCR-единицы, показало низкое отклонение при 10 повторениях при 21 и 30 градусах Цельсия. Точные испытания полевых приборов показали относительное стандартное отклонение ниже 5% на всех этапах.

Наши результаты действительно продвигают область, позволяя проводить экологический мониторинг в этих удалённых местах, что значительно способствует доступности, вовлечению сообщества и делает очень эффективные научные исследования. Наши результаты открыли путь к пониманию того, как образцы меняются во время отправки по сравнению с немедленной экстракцией и анализом. Будущие исследования будут сосредоточены на определении пределов этих методов для экстремальных образцов, таких как рассол, а также для экстремальных погодных условий.