Методы количественной оценки морфологии митохондрий in situ в мышечных и терминальных клетках Шванна мышей

Наше исследование впервые изучает морфологию митохондриальных клеток Шванна в нервно-мышечном соединении. Наш подход позволяет количественно оценивать морфологию митохондрий в труднодоступных тканях, таких как капиллярные и лимфатические слои. Для начала возьмите дикий тип и мышь D2-mdx.

После подтверждения глубины анестезии с помощью рефлекса «щипка пальцев» введите иглу в дистальное сухожилие ближе к правому колену. Введите 50 микролитров двухмикромолярного флуоресцентного митохондриального окрашивателя на внутреннюю часть большеберцовой мышцы, или ТА, одновременно выводя иглу по пути инъекции и инкубуйте краситель in vivo в течение одного часа. Во время содержания животного под наркозом используйте ножницы и щипцы для вскрытия и изоляции мышцы ТА перед эвтаназией.

Поместите изолированную ТА мышцу в 4% параформальдегида при комнатной температуре на 15 минут. Затем, под стереомикроскопом, аккуратно разделяйте волокна, дразни. Добавьте клеточно-пермерационную нуклеиновую кислоту к 4%-параформальдегиду для получения конечной концентрации от пяти до 10 микрограммов на миллилитр для ядерной маркировки.

Затем трижды помойте мышцу TA в PBS по пять минут каждый, чтобы удалить лишний краситель. Обезвоживайте мышцу последовательно 50%75% и 100% этанолом по пять минут каждая. Затем инкубировать образец последовательно в растворах для очищения тканей один и два по 30 минут каждый, убедившись, что он полностью погружен.

Положите мышцу на прикрывающий слой. Используйте стеклянный блок размером 2,5 на 2 на 1 сантиметр, весом 7,8 грамма, чтобы аккуратно расплющить его. Приобретите мышь S100 beta.

После подтверждения глубины анестезии с помощью рефлекса сжатия пальцев на ногах сделайте небольшой кожный разрез над большой ягодичной мышцей, или ГМ. Введите 75 микролитров двухмикромолярного флуоресцентного митохондриального окрашивателя под ГМ-мышцу. Закройте рану и дайте красителю инкубировать 45 минут, чтобы селективно метить терминальные клетки Шванна.

Во время содержания животного под наркозом вскрытие ГМ-мышцы в течение 10 минут и немедленно поместите её в охлаждённый физиологический раствор с содержанием 0,9%. Только если использовать мышей D2-mdx, добавьте краситель флуоресцентного ацетилхолинового рецептора в микродиссекционную ванну с разбавкой 1–500 и инкубировать ткань в течение 30 минут. Обрезайте лишний жир и соединительные ткани, а также перенесите мышцу ГМ на укрытие с вентральной стороной вниз для инвертированной микроскопии.

Добавьте два микролитра общей монтажной среды на дорсальную поверхность ГМ и расплющите ткань стеклянным блоком перед визуализацией. В программном обеспечении установите длину волны возбуждения на 646 нанометров. После добавления двух капель очищающего раствора второй выберите объективную линзу 63X, чтобы сфотографировать мышцу TA, и установите глубину стека Z около 100 микрометров.

Затем выберите режим деконволюции и примените оптимальные параметры. Установите размер шага на один микрометр и сделайте снимки. Для получения изображений терминальных клеток Шванна выберите объектив с увеличением в 20 раз, установите глубину Z-стека примерно на 17 микрометров и получите изображения.

Затем выберите объективную линзу с увеличением 63 раза и получите изображения отдельных терминальных клеток Шванна. Импортируйте отдельные Z-срезы, чтобы обучить программное обеспечение распознавать митохондриальный сигнал. И проводить количественный анализ с помощью программного обеспечения на базе искусственного интеллекта.

Разработайте маски для изображений для проверки следователем. Разделяйте стеки 3D-изображений на отдельные оптические секции в соответствии с оптимизацией алгоритма. Выберите каждый пятый Z-срез с каждого 3D-изображения и рассчитайте среднее значение на выборку.

Стандартизировать параметры визуализации для всех образцов и количественно оценить морфологию митохондрий. Провести иммуногистохимию и статистический анализ для оценки различий и корреляций групп. Митохондриальная связность у мышц mdx была снижена по сравнению с мышами дикого типа.

У mdx-мышей наблюдалось большее количество мелких митохондриальных фрагментов и уменьшенное число крупных взаимосвязанных митохондриальных сетей. У мышей дикого типа митохондрии в терминальных клетках Шванна демонстрировали взаимосвязанные петлеобразные структуры вблизи бифуркаций. В отличие от этого, у mdx-мышей митохондрии выглядели фрагментированными и не имели петлеобразных образований рядом с бифуркациями.

Конфокальная и электронная микроскопия подтвердили схожие пончиковидные митохондриальные структуры в терминальных клетках Шванна. Постсинаптический анализ показал, что субсарколеммальные митохондрии скопились вокруг ацетилхолиновых рецепторов, лишённые характерной структуры, похожей на крендель. Анализ изображений показал, что терминальные митохондрии клеток Шванна в мышце mdx демонстрируют увеличенную площадь и фрагментацию по сравнению с мышцами дикого типа, без различий в относительных размерах частиц.

Измерения мышечной силы показали уменьшение подёргивания с большей вариабельностью и уменьшение пиковой силы в мышцах MDX. Выработка силы при увеличении частот стимуляции также значительно снизилась в мышцах mdx. Мышца MDX показала сдвиг размера волокон влево, что указывает примерно на 60% меньше миоволокон по сравнению с диким типом.

Этот протокол позволяет исследователям изучать и количественно оценивать морфологию митохондрий в скелетных мышцах и терминальных клетках Шванна. Будущие исследования могут адаптировать этот подход для изучения морфологии митохондрий в микроциркуляционных и лимфатических сосудах.