Доклиническая модель синовита с использованием человеческой синовиальной ткани ex vivo с сохраненной функцией и архитектурой

Основными вопросами, на которые мы хотим ответить, являются следующие: какова является иммунная реакция синовиальной мембраны на инфекционные и воспалительные стимулы и как это отражается в изменениях структуры синовиальной оболочки? Моя основная клиническая и исследовательская деятельность направлена на лечение тяжело ожирелых пациентов с конечной стадией ревматоидного артрита. Часто в этой группе пациентов они остаются без медицинской помощи из-за трудностей с поиском хирургических вариантов лечения их заболевания.

Для начала выполните артротомию и диссекцию в операционной. Используйте стандартный медиальный парапателлярный подход и выполните более обширное открытие при операции на пациенте с тяжелым ожирением и конечной стадией остеоартроза. Определите переднюю синовиальную оболочку и используйте электрокоагуляцию для диссекции ткани.

Наблюдайте за коленным суставом на предмет признаков воспаления, так как пациенты с ожирением могут проявлять местную воспалительную реакцию, которая коррелирует с более широкими воспалительными эффектами ожирения. Передайте синовиальную оболочку члену исследовательской группы в стерильной манере. Поместите контейнер для образцов, наполненный холодным Dulbecco's PBS или DPBS, на лед и перенесите человеческую переднюю синoviaльную ткань, полученную во время эндопротезирования коленного сустава, в контейнер.

Промойте ткань дважды в холодном DPBS в течение 10 минут на платформе с качкой. Затем перенесите синовиальную оболочку в стерильную чашечку Петри диаметром 10 сантиметров или больше под шкафом биобезопасности уровня 2. Добавьте холодный стерильный DMEM с низким содержанием глюкозы, содержащий пируваты натрия и L-глутамин, чтобы заполнить чашку на половину.

Определите синовиальную оболочку по жемчужно-блестящему интиму без ее отделения. Разместите необходимые инструменты для получения биопсий объемом три миллиметра для минимум двух технических повторений. Используя ножницы для радужной оболочки или скальпель, отделите лишнюю жировую и стромальную ткань от прокаленной стороны, чтобы изолировать синовиальную оболочку, сохраняя глубину ткани примерно четыре-пять миллиметров на протяжении всей операции.

Меняйте среду в чашке Петри по мере необходимости для поддержания поля зрения. Расположите ткань так, чтобы синовиальная оболочка была обращена к инструменту для снятия биопсий. Стабилизируйте ткань недоминирующей рукой с помощью щипцев или гемостатов и возьмите биопсию, приложив твердое перпендикулярное давление с легким вращением.

Заменяйте биопсический пунч примерно через 10-15 применений или когда ткань скручивается при взятии биопсии, чтобы избежать повреждения структуры интиму. Откройте вторую чашку Петри и заполните ее пятью-десятью миллилитрами среды, содержащей 10%FBS, темперированного до 37 градусов Цельсия. С помощью плоских или беззубых щипцев перенесите ядра в чашку и легко агитируйте их в течение одной-двух секунд, чтобы удалить осадок без его сильного захвата.

Для подготовки нижнего колодца системы анализа суставного пространства добавьте 600 микролитров DMEM с низким содержанием глюкозы, содержащего 10%FBS, темперированного до 37 градусов Цельсия. Добавьте вехикулярный контроль или реагент лечения по выбору, такой как LPS или MCP-1, в нижний колодец. Выберите размер поры трансвелла на основе желаемого экспериментального результата и добавьте 300 микролитров DMEM с низким содержанием глюкозы, содержащего 10%FBS, в трансвелл.

Используя стерильные щипцы, аккуратно перенесите отдельные ядра ткани в среду трансвелла, избегая обрывков и плавающих ядер. Затем поместите сборку в инкубатор при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа на восемь-72 часа в зависимости от запланированных последующих анализов. Фиксируйте синовиальную ткань в 10%нейтральном буферном формалине.

Затем встраивайте и разрезайте ее для гистологического анализа. После окрашивания гематоксилином и эозином сфотографируйте секции ткани в 10-кратное и 40-кратное увеличение с использованием фотографии на фоне. Используйте Photoshop для нанесения контуров интимного слоя и сублинии в изображении TIFF 40X, затенив нецелевые области, эритроциты и крупные сосуды для последующего количественного анализа.

Анализируйте окончательные маски для количественной оценки толщины, целостности и клеточности интиму и сублинии. Наконец, оценивайте мигрирующие клетки методом потоковой цитометрии и растворимые факторы в собранной среде методом иммуноферментного анализа. Синовиальная ткань, культивированная с увеличивающимися дозами MCP-1 или LPS, показала различные изменения морфологии интиму, включая хрупкую интиму и утощенную интиму с пониженной