Упрощённый метод трансформации Phytophthora palmivora с помощью агробактерий

Этот протокол предлагает простую, эффективную и воспроизводимую систему преобразования phytophthora palmivora и phytophthora capsici. Для начала примите новую пластину для шнека LB с добавлением антибиотиков. Добавьте 20 микролитров жидкой среды LB в центр пластины и зачерпите клетки агробактерий из ранее выращенной пластины стерильной микроцентрифугой объёмом 1,5 миллилитра.

Используя нижнюю и плоскую основу трубки, равномерно распределите ячейки по пластине. Инкубировать тарелку ночью при 28 градусах Цельсия примерно 16–18 часов. Далее зачерпните клетки агробактерии, выращенные за ночь, с помощью наконечника пипетки объёмом один миллилитр.

Суспензируйте клетки в одном миллилитре индукционной среды агробактерии, проводя пипеты вверх и вниз. Теперь переместите вновь взвешенные клетки в стерильную трубку объёмом 50 миллилитров, покрытую фольгой, и добавьте индукционную среду агробактерии. Измерьте оптическую плотность образца на уровне 600 нанометров и разведите его индукционной средой агробактерии, чтобы получить оптическую плотность 0,4.

Затем ослабьте крышку трубки, покрытой фольгой, содержащей бактериальную суспензию. Поставьте его на платформенный шейкер с лёгким перемешиванием примерно 70 оборотов в минуту. Затопите семи-восьмидневное покрытие фитофтора пальмиворы 10 миллилитрами воды, предварительно охлаждённой до четырёх градусов Цельсия.

Используйте наконечник пипетки, чтобы аккуратно постукивать по поверхности и удалить воздуховые пузырьки на среде. Инкубировать тарелку при 4 градусах Цельсия в течение 15 минут. Затем перенесите её при комнатной температуре при свете ещё на 15 минут.

Используя пипетку, аккуратно перенесите примерно семь-восемь миллилитров высвобождённых зооспор в стерильную 15-миллилитровую центрифугную трубку, не нарушая мицелии и спорангии. Затем переведите 20 микролитров зооспорной суспензии в 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку и добавьте 180 микролитров воды, чтобы разбавить суспензию в десять раз. Проведите вихрь в трубке на одну минуту, чтобы настаивать на зооспорах, и используйте гемоцитометр под микроскопом для подсчёта зооспор.

Добавьте пять миллилитров подготовленной суспензии агробактерии к пяти миллилитрам зооспорной суспензии в стерильной трубке, покрытой фольгой, объёмом 50 миллилитров. Аккуратно перемешайте содержимое, ослабьте крышку тюбика и дайте постоять при комнатной температуре на два часа. Во время инкубации готовьте пластины AZCA.

Когда среда затвердеет, положите один кусок стерилизированной мембраны Hybond-N+ на пластину и держите пластину в темноте. После двух часов совместной инкубации используйте наконечник пипетки, чтобы распределить 300 микролитров смеси на мембрану Hybond-N+, чтобы края были свободны от жидкости. Оставьте чашки Петри открытыми в капюшоне примерно на 10 минут, чтобы смесь высохла на воздухе.

Когда жидкость перестанет двигаться по мембране, накройте пластины. Инкубировать покрытые тарелки при 25 градусах Цельсия в темноте в течение двух дней. После 48 часов инкубации используйте стерилизованные щипцы, чтобы перенести мембрану Hybond-N+ вверх ногами на пластину шнека Плиха, не перетаскивая её по поверхности шнека.

Используйте плоское основание микроцентрифугной трубки объёмом 1,5 миллилитра, чтобы аккуратно прижать и скользить по поверхности мембраны, чтобы обеспечить полный контакт с средой. Проверьте нижнюю сторону пластины на наличие пузырьков воздуха и аккуратно выжмите её, используя тот же ровный основание. Инкубировать тарелку при 25 градусах Цельсия при 12-часовом световом и 12-часовом тёмном цикле в течение двух-трёх дней.

Наконец, после двух-трёх дней инкубации удалите мембрану стерильными щипцами и продолжите инкубацию пластины при тех же условиях освещения и температуры. Совместная инкубация зооспор Phytophthora palmivora с агробактерией tumefaciens EHA 105, экспрессирующая pCB301TOR-GFP, дала колонии, устойчивые к G418, на шнеке Плиха с добавлением 30 микрограмм на миллилитр G418, тогда как на контрольных пластинах не было обнаружено колоний без инфекции агробактериями. Количество трансформаторов, устойчивых к G418, на 10 питающих семь зооспор, составляло 55 в первом эксперименте и 50 во втором.

Флуоресцентная микроскопия подтвердила чистый сигнал зелёного флуоресцентного белка в трансформантах phytophthora palmivora. Кроме того, этот протокол применялся к phytophthora capsici для успешной генерации трансформаторов, экспрессирующих GFP. Наш протокол позволяет исследователям изучать функции генов, определять локализацию клеток белков и отслеживать динамику инфекции патогенами.

Эти протоколы могут генерировать низкий процент ложноположительных результатов и, следовательно, требуют дополнительных подходов для подтверждения истинных трансформаторов. Применение этой системы трансформации можно распространить на другие оомицеты и грибы. В будущем мы также постараемся ещё больше упростить этот протокол.