Новая платформа для экстракорпорального клеточного растяжения и визуализации
10 марта 2026 г.
Здесь мы представляем новое устройство, которое применяет изотропные и униаксиальные формы волн деформации к клеткам, поддерживая культуру на субстратах с регулируемой жёсткостью и настраиваемыми белковыми матрицами. Эта простая и экономичная платформа позволяет исследователям изучать, как механические сигналы регулируют функцию клеток как в фундаментальных исследованиях, так и в контекстах, связанных с заболеваниями.
Нашей целью было разработать недорогое устройство для растяжения клеток, совместимое с микроскопом, вдохновлённое Хоберманом, чтобы исследовать, как механическое растяжение влияет на функцию клеток. Это устройство позволяет исследователям изучать реакции жизненных клеток на механические стимулы, имитируя физиологические системы, такие как биение сердца или дышащие лёгкие. Для начала, где это уместно, средства индивидуальной защиты.
Смешайте основу Silgard 184 и сушитель в соотношении 10 к одному в пластиковой чаше. С помощью депрессора для языка энергично перемешайте ингредиенты в течение двух-трёх минут. Затем поместите блюдо в камеру для дегазации на один час.
Далее возьмите подготовленные 3D-печатные формы и добавьте 1,3 грамма смеси PDMS в изотропную форму. Затем добавьте 0,5 грамма смеси PDMS в уни-аксиальную форму. Равномерно нанесите гель по форме и дегазируйте заполненную форму в течение часа.
Дайте гелю в форме осесть на ровной поверхности при комнатной температуре в течение двух часов. Затем затвердейте форму в духовке при 60 градусах Цельсия на ночь. Затем смешайте части A и B геля NuSil 8100 в равных пропорциях.
Смешайте комбинированный гель с перекрестным сшивателем silgard 184 при 0,36% от общего объёма, чтобы получить жёсткость субстрата 13 килопаскаль. Чтобы получить мягкий субстрат с жёсткостью 0,3 килопаскаль, пропустите добавление сшивателя, затем перемешайте раствор в течение 15 минут. Поместите смесь NuSil в камеру для дегазации и дегазируйте 30 минут.
Теперь аккуратно вынимите гель PDMS из индивидуальной формы и наместите его на 40-миллиметровую защиту, не порвя его. Далее поместите гель PDMS в спин-кодер. Пипетте 100 микролитров смеси NuSil на отрицательную область изотропного геля PDMS.
Затем пипетка 50 микролитров смеси NuSil на отрицательную область одного аксиального геля PDMS. После этого код на 7 G в течение 50 секунд. Для достижения толщины 100 микрометров.
Дайте покрытому гелю осесть на ровной поверхности при комнатной температуре в течение двух часов. Поместите гель в духовку и затвердейте при 60 градусах Цельсия на ночь. Теперь посеять человеческие дыхательные пути, гладкомышечные клетки в эластичных клетках и инкубировать в стандартных условиях.
После этого смешайте клетки с раствором FLIPR Calcium six для визуализации. Для измерения тяговой силы покрытие гель-подложки PDMS NuSil слоем флуоресцентных шариков, которые служат фидуциарными маркерами. Приготовьте 0,025% раствор микросфер с красной флуоресцентной карбоксилатной модифицированной микросферой диаметром один микрометр в HBSS.
Используя вихревой миксер, раствор шарика в течение 10 секунд. Затем пипетить 880 микролитров раствора шарика в изотропный гель. Добавьте 420 микролитров бусинного раствора в один аксиальный гель.
После инкубации геля при комнатной температуре в течение часа аккуратно удалите раствор бусины, чтобы сохранить распределение бусин. Затем используйте ватную палочку или лабораторную салфетку, чтобы аккуратно промить остатки раствора с поверхности геля. Далее используйте перевёрнутый микроскоп с камерой, световым двигателем и объективом 10 x сухим изображением.
Установите возбуждение на 475 на 40 нанометров и на 555 на 50 нанометров. Получайте 16-битные изображения с частотой кадров два герца во время экспериментов с растяжением. Теперь нанесите изотропный гель на подрамник и сделайте изображение флуоресцентных шариков с помощью инвертированного микроскопа с 10-кратным сухим объективом. Захват изображений в состоянии предварительного растяжения.
Непрерывно захватывайте изображения на протяжении всего протокола растяжения в центре подложки. При необходимости перефокусируйте микроскоп в растянутом положении перед запечатлением изображений. Проанализируйте изображения с помощью индивидуального кода MATLAB, основанного на микроскопии силы тяги Furier, чтобы рассчитать векторы смещения и соответствующие поля плоских деформаций.
Представить данные как среднее по итоговым испытаниям. Применение смещения в 240 микрометров приводило к тому, что флуоресцентные шарики радиально смещивались наружу от центра. Микроскопия силы тяги выявила изотропное поле смещения с векторами, излучающими наружу от центра и увеличивающимися по величине с расстоянием.
Изотропное поле смещения создавало однородное плоское деформационное поле. Увеличение смещения до 1000 микрометров приводило к появлению векторов смещения, которые увеличивались по величине при сохранении радиальной ориентации. Соответствующее поле деформации на 1000 микрометров увеличилось в величине, оставаясь при этом радиально симметричным.
В одноосевых гелях, подвергшихся смещению 250 микрометров, векторы смещения преимущественно располагались вдоль одной оси, что соответствует одноосевой деформации. Формы волн деформации близко повторяли запрограммированные перемещения двигателей и оставались синхронизированными на протяжении трёх повторяющихся циклов. Значения деформации при максимальном смещении оставались неизменными для трёх независимых образцов.
Применение временного смещения до 5 555 микрометров дало штаммы от 0,1% до 12%A, что вызывало увеличение внутриклеточного кальция, что проявляется как более высокая флуоресцентная интенсивность после растяжения. Используя наши носилки, исследователи могут проводить кальциевую визуализацию живых клеток, микроскопию с тяговой силой и количественно оценивать клеточные механические реакции на изотропное или одноосевое растяжение. Критически важным шагом является обеспечение затвердевания гелей на ровной поверхности, так как неравномерная толщина может сместить подложку из фокуса и снизить оптическую чёткость во время живой съёмки.
Будущие исследования могут исследовать переориентацию цитоскелета, вызванную растяжением, патологические состояния, связанные с астмой или повреждением лёгких, а также различные типы клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается разработка и применение недорогого устройства для растяжения клеток, совместимого с микроскопом и основанного на механизме Хобермана. Устройство позволяет исследователям воздействовать на адгезивные клетки, культивируемые на эластомерных подложках с регулируемой жесткостью, контролируемым изотропным или одноосным механическим напряжением, что облегчает визуализацию живых клеток и количественный анализ клеточных ответов на механические стимулы. Возможности платформы продемонстрированы на примере первичных гладкомышечных клеток дыхательных путей человека с измерением динамики внутриклеточного кальция и сил тяги клеток при механическом растяжении.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биомеханика
- Механобиология
- Биоинженерия
Теоретическая база
- Клетки воспринимают и реагируют на механические стимулы, такие как жесткость внеклеточного матрикса (ВКМ) и циклическое растяжение.
- Механические силы регулируют такие процессы, как определение судьбы клетки, межклеточная коммуникация и развитие.
- Измененная механическая среда способствует развитию различных заболеваний, включая астму, гипертонию и рак.
- Существующие устройства для растяжения in vitro часто не обладают физиологической релевантностью или совместимостью с визуализацией живых клеток.
Цель исследования
- Разработка компактного, экономичного и совместимого с микроскопом устройства для растяжения при исследовании живых клеток.
- Обеспечение возможности контролируемого приложения изотропной или одноосной деформации к клеткам на подложках с регулируемыми свойствами.
- Обеспечение условий для количественного анализа клеточных ответов на механическое растяжение.
Используемые методы
- Изготовление эластомерных культуральных чашек на основе PDMS и NuSil с регулируемой жесткостью (0,3–13 kPa).
- Покрытие подложек матриксными белками и флуоресцентными микросферами для адгезии клеток и микроскопии тяговых сил.
- Посев первичных гладкомышечных клеток дыхательных путей человека и проведение визуализации кальция в живых клетках с использованием FLIPR Calcium 6.
- Применение программируемого механического растяжения с помощью устройства с шаговым двигателем, а также визуализация и анализ с использованием специального кода MATLAB для количественной оценки тяговых сил и поля деформации.
Основные результаты
- Устройство создавало контролируемые изотропные и одноосные поля деформации, что было подтверждено картированием смещения и деформации флуоресцентных микросфер.
- Формы волн деформации точно соответствовали запрограммированным перемещениям двигателя и были воспроизводимы в разных образцах.
- Механическое растяжение вызывало измеримое повышение уровня внутриклеточного кальция в гладкомышечных клетках дыхательных путей.
- Микроскопия тяговых усилий выявила однородные плоские поля деформации при изотропном растяжении и смещение вдоль оси при одноосном растяжении.
Выводы
- Разработанное устройство для растяжения позволяет проводить точные исследования механических ответов живых клеток в физиологически релевантных условиях.
- Оно обеспечивает независимую модуляцию жесткости субстрата и состава внеклеточного матрикса (ECM).
- Данная платформа универсальна для исследования механотрансдукции при нормальном состоянии и патологии, а также может быть адаптирована для различных типов клеток и моделей патологического растяжения.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Механотрансдукция является критически важным звеном в моделировании заболеваний и валидации мишеней, однако большинству систем in vitro не хватает физиологической релевантности или количественной строгости. Данная платформа обеспечивает программируемую, физиологически релевантную механическую стимуляцию адгезивных клеток с визуализацией в реальном времени и количественным анализом данных, что повышает прогностическую достоверность на этапах раннего поиска и трансляционных исследований. Благодаря модульности и воспроизводимости эта система представляет собой многоразовый инструмент для снижения рисков при изучении механизмов и сортировки портфеля проектов в биофармацевтических исследованиях и разработках (R&D).
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механочувствительные пути и клеточные ответы в условиях контролируемой деформации.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем количественной оценки динамики внутриклеточного кальция и сил тяги.
- Способствует снижению биологических рисков за счет моделирования механических условий, релевантных для конкретных заболеваний.
- Обеспечивает прогностическую уверенность в отношении мишеней механотрансдукции в контексте сложных заболеваний.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные субстраты с регулируемой жесткостью для последующих рабочих процессов скрининга соединений.
- Стандартизирует протоколы механической стимуляции для получения воспроизводимых количественных результатов.
- Обеспечивает возможность высококонтентного прижизненного имиджинга и мультиплексного считывания данных в процессе механического воздействия.
- Поддерживает масштабируемую разработку анализа для фенотипического скрининга на основе принципов механобиологии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласует механические стимулы in vitro с условиями деформации, характерными для заболевания, для обеспечения трансляционной преемственности.
- Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков путем количественной оценки клеточной адаптации к патологической деформации.
- Способствует поиску биомаркеров путем установления связи между механическими воздействиями и функциональными ответами клеток.
- Облегчает снижение механистических рисков при выборе и валидации доклинических моделей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная платформа связывает этапы первичного поиска, разработки анализов и трансляционных исследований, обеспечивая возможность проведения исследований механотрансдукции на основе выдвинутых гипотез с получением количественных результатов.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о механочувствительных путях и принятии решений о судьбе клеток при программируемой деформации.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели для оценки соединений в механически динамических системах.
- Аналитика: предоставляет измерения смещения, деформации и динамики кальция для надежного сравнения условий.
- Трансляционные исследования: моделирует механические среды, имеющие значение для заболевания, для обеспечения доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: предлагает модульную, совместимую с микроскопом систему, адаптируемую для различных типов клеток и моделей заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает неопределенность механизмов при валидации мишени.
- Операционная ценность: Стандартизирует процессы механической стимуляции и визуализации для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более обоснованное принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет раннего снижения рисков, связанных с мишенями механотрансдукции.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение программ, основанных на принципах механобиологии.
Особенности внедрения
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток, механобиологии и количественного анализа изображений.
- Необходим доступ к инвертированному флуоресцентному микроскопу и специализированному аналитическому программному обеспечению (например, MATLAB).
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов подготовки субстрата и механической стимуляции.
- Метод адаптируем к различным типам клеток и составам внеклеточного матрикса с регулируемой жесткостью субстрата.
- Равномерная толщина геля и оптическая прозрачность имеют решающее значение для получения высококачественных изображений и обеспечения целостности данных.
