Холинергическая лиганд-зависимая модуляция окислительного фосфорилирования в клетках нейробластомы BE(2)-C с дигитонином-пермеабилизированной

Общая цель этого эксперимента — продемонстрировать метод оценки митохондриальной биоэнергетики в целостных культивированных клетках нейробластомы с использованием селективной проницаемости и комбинации ингибиторов субстрата. Традиционно митохондриальное дыхание оценивается с помощью приборов, таких как высокоразрешающий респирометр Oroboros O2K, кислородный электрод типа Кларка и анализатор Seahorse XF. Традиционные методы, основанные на изолированной или обогащённой митохондриальной фракции тканей или клеток, часто нарушают структуру митохондрий.

Например, это изображение митохондрий с помощью пропускного электронного микроскопа, выделенных из коры мыши, показывает явный контраст структурной целостности в зависимости от того, заключены ли митохондрии в пресинаптические терминалы или нет. Митохондрии, которые остаются в капсуле в пресинаптических терминалах, выглядят структурно целыми, что видно по голубым стрелкам на этой фотографии. В отличие от этого, митохондрии, не инкапсулированные или отсутствующие окружающие мембранные структуры, часто выглядят деформированными, что показано жёлтыми стрелками.

Анализатор Seahorse Flex широко используется для изучения биоэнергетики митохондрий как в культивируемых клетках, так и в изолированных митохондриях. В анализе на основе культивируемых клеток сохраняется клеточная архитектура и сигнальные сети. Однако плазматическая мембрана целостных клеток непроницаема для многих субстратов цикла трикарбоновой кислоты.

Это ограничивает возможности метаболического анализа по сравнению с изолированными митохондриями, которые не имеют барьера плазматической мембраны, но часто демонстрируют структурные артефакты. Таким образом, обе системы имеют врожденные ограничения. Представленная здесь техника использует тот факт, что плазматическая мембрана богата холестерином, тогда как митохондриальная мембрана содержит его очень мало.

Используя детергент, связывающий холестерин, такой как дигитонин, мы можем селективно проникать плазматическую мембрану, оставляя митохондриальную мембрану нетронутой. Такой подход позволяет контролируемо проникнуть митохондриальные субстраты и ингибиторы в клетку без ущерба целостности органеллы. Таким образом, эта техника позволяет проводить функциональный анализ митохондрий в контексте целостных клеток, сочетая преимущества целостной клеточной архитектуры с доступностью изолированных митохондриальных анализов.

Начните эксперимент с субфлюентной культурной чаши ваших клеток. Аккуратно промыйте клетки стерильным фосфатным буфером. Добавьте соответствующее количество раствора тритона, чтобы равномерно покрыть монослой клетки. После инкубации снимите чашу и аккуратно постучите или встряхните по ней горизонтально, чтобы помочь вывести клетки.

Используя пятимиллиметровую пипетку и контроллер, подвеска ячейки поднимается и опускается несколько раз, чтобы разрушить любой комок и добиться подвешивания одной ячейки. Изучите суспензию клетки под микроскопом, чтобы подтвердить равномерное подвешивание одной клетки. Считайте клетки с помощью гемоцитометра или автоматического счётчика клеток.

Отрегулируйте концентрацию ячеек так, чтобы 100 микролитров суспензии содержало примерно 10 000 элементов. Аккуратно разгоняйте 100 микролитров суспензии ячейки в каждую яме на пробной пластине Seahorse XF. Оставьте один колодец пустым для контроля фона во время анализа.

Инкубировать пластину в инкубаторе для клеточной культуры в течение двух-трёх часов, чтобы клетки прилипли к дну колодца. После прикрепления клеток аккуратно добавьте в каждую скважину 300 микролитров пробирального материала. Верните пластину в инкубатор и инкубируем на ночь, чтобы клетки стабилизировались и выросли.

Убедитесь, что клетки образуют равномерный монослой на дне каждой скважины. Избегайте переполнения. Клетки должны быть слитыми, но не чрезмерно слияться, чтобы обеспечить оптимальную эффективность анализа.

Накануне эксперимента увлажните картридж датчика XFp 24, добавив по одному мл калибровочного буфера в каждую скважину. В качестве альтернативы можно использовать фосфатный буферный физиологический раствор, pH 7.4. Оставьте картридж при комнатной температуре на ночь на кровати.

Инкубация в не-COT инкубаторе при 37 градусах Цельсия не требуется, так как патрон будет уравновешивать комнатную температуру в процессе загрузки. Используйте все замороженные стандартные растворы и двухкратный микроглиальный буфер при комнатной температуре. Проверьте pH, он должен быть 7.4.

При необходимости корректируйте. Подготовьте весь субстрат и растворы для инъекции и снова проверьте pH. Держите все растворы на льду до использования.

Подготовьте пищевые трубки с маркировкой A, B, C и D для растворов для инъекции в сенсорные картриджи. Лучше всего делать растворы с соответствующими ингибиторами или субстратами для каждого порта. Используя многоканальную пипетку, аккуратно загрузите 50 микролитров раствора каждого порта инжекции в соответствующие порты от A до D.

Запустите биоанализатор Seahorse за один-два часа до эксперимента, чтобы внутренний инкубатор стабилизировался на 37 градусах Цельсия. Маркируйте каждую скважину и группируйте по своему экспериментальному дизайну и рекомендациям Wave Desktop 2.6. Запрограммируйте биоанализатор на соответствующий цикл смеси, веса и измерения.

См. таблицу 8 для справки. Важно отключить опцию равновесия в начале цикла измерений. Если держать её включённым, эксперимент будет излишне затянуты и может истощить субстраты.

Запустите. Машина сначала откалибрует сенсорный картридж, что занимает примерно 15 минут. Начинайте подготовку яченой пластины сразу после установки сенсорного картриджа в калибровку. Аккуратно аспирируйте буфер, не нарушая клетки, примерно 700 микролитров буфера 1x митохондриального анализа в каждую яму, с прилипшими клетками, и дайте пластине постоять одну минуту для уравновесия.

Аккуратно аспирируйте буфер из каждой ямы, не нарушая прилипшие клетки. Повторите шаг стиральной машины три раза, чтобы обеспечить полный средний эффект. Параллельно добавьте 50 микролитров митохондриального буфера в фоновую яме без клеток.

Используйте мениск как визуальный ориентир для согласованности объёма. Аккуратно аспирируйте буфер из клеточных колодцев, оставляя примерно 50 микролитров для поддержания гидратации клетки. Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия, либо в водяной бане, держа её над поверхностью воды, либо в несталёвом инкубаторе с насыщенной атмосферой, чтобы предотвратить испарение.

Непосредственно перед загрузкой в анализатор добавьте в каждую скважину 450 микролитров предварительно нагретого митохондриального буфера с субстратами, ингибиторами или препаратами по необходимости, увеличивая общий объём до 500 микролитров. Теперь пластина готова к анализу с использованием откалиброванного сенсорного картриджа в биоанализаторе Seahorse. Сначала мы проводим анализ связи для изучения степени связи между системой электронного транспорта и окислительным фосфорилированием.

Анализ связи помогает отличить функцию митохондрий от дисфункции. На этой диаграмме системы транспорта электронов митохондрий мы показываем сложные один, три и пять специфических ингибиторов вместе с узлами различных субстратов, таких как пируват или малате, и сукцинат передают электроны системе. Эта визуализация полезна для понимания работы анализа и роли различных субстратов и ингибиторов.

Сначала мы изучаем две разные концентрации дигитонина — пять микромолярных и десять микромолярных — на предмет их эффективности в облегчении транспортировки электронов через плазматическую мембрану и в обеспечении проведения анализа связи. В этом анализе уровень респираторной связи оценивался последовательно с последовательной скоростью потребления кислорода в присутствии сукцината в качестве субстрата и ротенона как комплексного ингибитора. ADP, олигомицин, FCCP и антимицин A затем вводились последовательно, а измерения OCR записывались после каждой инъекции.

На левой панели изображены линейные графики, показывающие кинетическое напряжение кислорода внутри временной микрокамеры. Обычно это значение должно оставаться в диапазоне от 100 до 200 миллиметров ртути для обеспечения обнаружения в динамическом диапазоне датчика. Эти наборы данных были сгенерированы с использованием режима point-to-point в программном обеспечении Agilent Wave, которое отображает OCR в виде серии скоростей на протяжении периода измерения, позволяя визуализировать динамические изменения, в частности, 10 микромолярных дигитонина увеличили транспорт сукцината по сравнению с пятью микромолярами, что привело к снижению натяжения кислорода в микрокамере и, соответственно, более высокому поглощению кислорода.

Построение данных, полученных в ходе этих экспериментов, показало, что базальное дыхание, опосредованное комплексами от два-четырёх, было значительно выше при 10 микромолярном дигитонине по сравнению с пятью микромолярами, что свидетельствует о более эффективном транспорте сукцината через проницаемую плазматическую мембрану при высокой концентрации. Основываясь на этих наблюдениях и учитывая, что 10 микромолярных дигитонина обеспечивали оптимальную проницаемость, мы впоследствии сократили количество клеток до 20 000 клеток на яму, чтобы снизить базальное дыхание. Эта корректировка обеспечила, что любое усиление дыхания, вызванное лекарством или субстратом, оставалось в динамическом диапазоне обнаружения системы.

После оптимизации концентрации дигитонина и количества клеток проводился следующий анализ соединения для оценки влияния агонистов и антагонистов мускариновых на митохондриальное дыхание. Одним из важных выводов этого набора экспериментов стало то, что в необработанных клетках дигитонина базальное дыхание, опосредованное сукцинатными комплексами с два-четырьмя уровнями, а также дыхание состояния-3 и состояния-3u, было значительно снижено. Это указывает на то, что сукцинат не был транспортирован в клетку при непроницаемых условиях.

Построение данных из нескольких независимых экспериментов показало, что мускариновый антагонист атропин значительно снижал базальное дыхание, опосредованное комплексами от двух до четырёх в клетках нейробластомы, по сравнению с мускариновым агонистом ацетилхолина, который поддерживал высокий уровень дыхания. Кроме того, дыхание в состоянии 3 и состояние 3u было значительно ниже в непермеабилизированных клетках, чем в пермеабилизированных клетках, что подчёркивает эффективность дигитонина в селективной пермеабилизации плазматической мембраны без нарушения функции митохондрий. Анализ потока электронов оценивает последовательный перенос электронов в цепь переноса электронов митохондриальных электронов, помогая выявить механизмы дисфункции или модуляции митохондрий.

На начальной фазе анализа клетки обрабатывали пируватом, малатом и FCCP, что вызывало высокий уровень несвязанного дыхания под действием комплексов с первого по четыре. Последующее добавление ротенона ингибировало комплекс один, снижая базальное дыхание и изолируя активность комплекса от двух до четвёртых. Хотя мы не наблюдали значимых различий между состояниями и контролем, одним из важных наблюдений стало то, что дыхание состояния-3u, вызванное сукцинатом, было значительно ниже в непермеабилизированных клетках, что указывает на критическую роль дигитонина, обеспечивающего попадание сукцината в клетку.

В заключение, этот протокол предлагает надёжный способ изучения биоэнергетики митохондриальных исследований. Он сочетает физиологическую значимость целостной клеточной архитектуры с точностью изолированных митохондриальных анализов, позволяя контролируемую доставку субстратов и ингибиторов при сохранении целостности органеллы. Оптимизируя концентрацию дигитонина и плотность клеток, исследователи могут добиться точных и воспроизводимых измерений.

Такой адаптивный подход идеально подходит для изучения модуляции функции митохондрий с помощью рецепторов и предоставляет мощную платформу для исследований заболеваний и открытия лекарств.