Chromatin Accessibility Profiling in Whole Caenorhabditis elegans L4 Larvae

Наше исследование фокусируется на том, как эпигенетическая регуляция формирует экспрессию генов, в частности, как доступность хроматина контролирует активность генов в различных биологических условиях. ATAC-seq в C.elegans ограничен его защитной оболочкой. Наши протоколы преодолевают этот барьер, чтобы обеспечить надежный анализ доступности хроматина.

Для начала получите синхронную популяцию червей L1 и дайте им вырасти в течение 26 часов при 20 градусах Цельсия. Подтвердите под микроскопом, что большинство червей находятся на стадии L4. Выделите всех червей из пластинок с буфером M9 и перенесите их в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра.

Промойте червей пять раз с одним миллилитром стерильной воды, оставив их оседать под действием гравитации. Затем перенесите пробирку с червями в инкубатор при 25 градусах Цельсия на 30 минут для удаления остатков пищи из кишечника. Затем возьмите 50 микролитров пеллет червей и поместите его в новую пробирку.

Для лизиса червей добавьте 200 микролитров свежего буфера SDS-DTT и взбели в ротаторе пробирок в течение ровно пяти минут. Затем добавьте один миллилитр холодного буфера яиц. Затем центрифугируйте на пикофуге, чтобы удалить супернатант, и повторите шесть раз.

После этого добавьте 80 микролитров свежеприготовленного проназа. Используя пипетку на 200 микролитров с фильтрованными наконечниками, перемешайте смесь червей и проназа 70 раз и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте 800 микролитров среды L15 с 10% сывороткой бычьей плодовитости и центрифугируйте при 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

После удаления супернатанта добавьте один миллилитр среды L15 с 10% сывороткой бычьей плодовитости и центрифугируйте, как это было продемонстрировано ранее. После того, как пеллет промоют три раза, удалите супернатант и ресуспендируйте пеллет в 900 микролитрах среды L15 с 10% сывороткой бычьей плодовитости. Затем процедите суспензию через фильтр с размером пор 20 микрометров.

Центрифугируйте отфильтрованную клеточную суспензию при 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Затем удалите супернатант, оставив примерно 50 микролитров. Добавьте 45 микролитров свежеприготовленного лизисного буфера и осторожно ресуспендируйте образец.

Затем осторожно добавьте 50 микролитров буфера для промывки, не смешивая образец. Центрифугируйте при 500G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант и держите образец на льду.

Во время центрифугирования приготовьте смесь TN5 на образец, соединив 25 микролитров буфера TN5, 24,8 микролитра безнуклеазной воды и 0,2 микролитра фермента TN5. После центрифугирования удалите супернатант и оставьте ядра на льду. Добавьте 50 микролитров смеси TN5 к ядерному пеллету.

Затем пипеткой перемешайте семь раз, чтобы смешать. Инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут на термоблоке и аккуратно постукивайте по пробирке каждые 10 минут. После инкубации с TN5 добавьте 300 микролитров буфера PB и взбели максимальной скоростью вортекса в течение 25 секунд.

Перенесите всю объем из пробирки в спиновую колонку. Центрифугируйте при комнатной температуре в течение одной минуты на максимальной скорости. Добавьте 750 микролитров буфера PE в спиновую колонку и снова центрифугируйте.

Затем отбросьте супернатант с коллекционной пробиркой. После пустой спинации поместите колонку в новую пробирку объемом 1,5 миллилитра с меткой. Добавьте 10 микролитров буфера EB при 37 градусах Цельсия в центр колонки, не касаясь ее.

Оставьте на комнатной температуре в течение одной минуты. Затем центрифугируйте в течение одной минуты на максимальной скорости при комнатной температуре. Затем повторите шаги элюции, чтобы получить конечный объем 20 микролитров в буфере EB.

Проведите реальный ПЦР, чтобы оценить подходящее число циклов амплификации для амплификации библиотеки ATAC. Оцените окончательное число амплификационных циклов, выбрав цикл, на котором сигнал амплификации достигает 1/3 его максимума для каждого образца. Проведите окончательную амплификацию для библиотеки ATAC и назначьте каждому образцу другой обратный праймер и зафиксируйте это.

Усильте каждый образец на оцененное число циклов для этого образца. Проведите представленную полимеразную цепную реакцию в пробирках объемом 200 микролитров с использ