Микродиссекция с помощью лазерного захвата ткани печени мышей, фиксированной на параформальдегиде, для анализа РНК
April 17th, 2026
Этот протокол описывает метод изоляции РНК из определённых гистологических областей тканей печени мышей с фиксированным параформальдегидом с оптимальной температурой резки с помощью микродиссекции лазерного захвата, что позволяет проводить целенаправленный анализ экспрессии генов на последующих этапах.
Наши исследования в основном посвящены патофизиологии, связанной с гепатоцитами, в контексте хронических заболеваний печени. Этот протокол позволяет выделить клетки в срезах печени и экстракцию РНК. В отличие от FFPE, параформальдегидно-фиксированных или CT-протоколов, сохраняются и итегрированы, что позволяет проводить точное микрообсуждение и качественные образцы для дальнейшего OMI-анализа.
Для начала экспонирования слайдов с перо-мембраной ультрафиолетового света — четыре 30 минут. Покройте затворы 0,1 миллиграмма на миллилитр поли L-лизина и дайте им высохнуть на воздухе. Запечатайте края каждого затвора нейтральным монтажным материалом.
С помощью агента для дезактивации РНазы протри все доступные поверхности криостата и все инструменты. Использую 75% этанола. Тщательно очистите кисть и инструменты.
Теперь установите температуру криостата на минус 20 градусов Цельсия и дайте ей стабилизироваться. Возьмите образцы печени из хранилища с минус 80 градусами Цельсия. Поместите образцы в криостатную камеру минимум на 15 минут для уравновесия.
Нанесите слой OCT толщиной от двух до трёх миллиметров на стадию образца. Затем разместите этап образца на быстрой свободной полке или внутри камеры криостата, чтобы предварительно затвердеть слой соединения. После нанесения небольшого количества ОКТ на затвердевший слой разместите уравновешенный блок ткани горизонтально на соединение и удержите его на месте 10–15 секунд.
Затем установите стадию образца с прикреплённым блоком ткани на головку криостата. Теперь аккуратно вставьте лезвие между зажимными пластинами и задними пластинами с одной стороны криостата. Зажмите рычаг зажима, чтобы закрепить лезвие.
Настройте толщину криостата на 10 микрометров. Разрежьте ткань на секции и закрепите их непосредственно на предварительно обработанных слайдах перо-мембраны внутри камеры криостата, поддерживаемых при минус 20 градусах Цельсия. Разморозьте слайды при комнатной температуре на 20 минут.
Мойте стекли три раза с помощью RN ACE free PBS по четыре 10 секунд за каждую стирку. Добавьте фильтрованный раствор гематоксилина Майера на тканевые срезы на пять-десять секунд. Затем промыйте стекли три раза водой без рибонуклеазы по 10 секунд за каждую стирку, чтобы удалить остатки гематоксилина.
Оцените качество окрашивания под микроскопом. Используя впитывающую бумагу, промокните стекли до сушки и дайте им полностью высохнуть на воздухе. Протрите поверхность лабораторного стола средством для дезактивации РНаз.
Включите контроллер и дайте микроскопу завершить инициализацию. Поверните ключ по часовой стрелке с положения выключено в включённое, чтобы запустить лазерную систему. Включите компьютер и запустите программное обеспечение для микродиссекции лазера.
Затем ждите завершения инициализации. Теперь вставьте стерильную ПЦР-трубку объёмом 0,2 миллилитра в устройство для сбора. С помощью пипетки добавьте 10 микролитров буфера для пваривания протеазы K к крышке ПЦР-трубки.
Загрузите устройство для сбора в держатель для образцов микроскопа. В окне устройства сборщика изменений. Выберите регулировку опорной точки, настройте фокус камеры, чтобы чётко видеть точку отсчёта, и при необходимости используйте стрелки для центрирования.
Загрузите срез ткани в держатель образца так, чтобы ткань была обращена вниз, а маркировка — справа. Выберите объектив 10 x объективов и определите интересующие области с определёнными патологическими признаками. Перейдите в меню лазера.
Нажмите «калибровать», выберите «да» и завершите калибровку. В панели управления лазером установите мощность лазера на 50, диафрагму на пять и скорость на девять. Затем используйте графическую панель инструментов, чтобы нарисовать круг вокруг целевой области.
Выберите одну форму, нажмите старт, чтобы выполнить микродиссекцию лазера, и разместить устройство для сбора вскрытой ткани. Чтобы захватить документацию, изображения, выберите файл и выберите сохранение изображений для сохранения изображений до и после в предпочтительном формате. После сбора нужных ячеек нажмите «разгрузить», чтобы убрать коллектор со сцены.
Проверьте, что в крышке осталось 10 микролитров буфера для пищеварения протеазы K, и при необходимости пополните. Закройте трубку и тщательно запустите её в вихре. Затем ненадолго прокрутите трубку в центрифуге.
Храните трубку при минус 80 градусах Цельсия до экстракции РНК. Гематоксилин-окрашенный срез печени на ручном стекле визуализировался под микроскопом до и после микродиссекции лазерного захвата. Интересующие области с микровезикулярным стеатозом были точно собраны в крышку ПЦР-трубки А.
Сохраняя целостную клеточную морфологию. Общая рибонуклеиновая кислота, извлеченная примерно из 1000 и 2000 изолированных клеток лазерного захвата, дала соответственно 110,7 нанограмма и 213,3 нанограмма. Все образцы показали высокую чистоту с поглощением соотношения 260 на 280 нанометров в диапазоне от 1,9 до 2,1.
Гель-электрофорез выявил чёткие рибосомные и 18-секундные рибосомные нуклеиновые кислоты. Биоанализатор анализирует профили рибонуклеиновой кислоты всего из 1000 клеток. Показатель целостности рибонуклеиновой кислоты составил 6,7.
Q-R-T-P-C-R для бета-актина давал порог цикла от 17 до 19. Биоанализаторная оценка секвенирующих библиотек, построенных из 50 нанограммов общей рибонуклеиновой кислоты, показала характерный пик между 300 и 500 парами оснований. Секвенирование РНК этих библиотек дало высококачественные данные с результатами Q 20 и Q 30, превышая 90%, и низким уровнем ошибок между репликами.
Важным фактором является предотвращение антидеградации с помощью контролируемого прекращения, быстрого окрашивания и прямых условий в нашей обработке. Упорядочивая эту процедуру, она может использоваться для ПЦР в реальном времени и секвенирования с помощью фрагментационно оптимизированных ключей библиотеки. Установлен в образцах печени.
Этот протокол позволяет профилировать подгруппы гепатоцитов и поддерживает исследования в области патологии, ориентированной на патологию.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
