Протокол для извлечения суспензии с одной клеточной суспензией роговицы мыши
3 апреля 2026 г.
Здесь мы представляем протокол получения высококачественных одноклеточных суспензий из целых роговиц мышей посредством последовательного расщепления с помощью коллагеназы А и трипсина. Этот метод даёт жизнеспособные одиночные клетки с высокой целостностью РНК, что делает их совместимыми с последующим применением, такими как секвенирование одноклеточной РНК и потоковый цитометрy.
Этот протокол в первую очередь вводит метод получения высококачественных отдельных клеток из целых роговиц мышей. Наш метод — жизнеспособные одиночные клетки с высокой целостностью РНК, что делает их совместимыми с последующим применением, такими как одиночные клетки на толстом тонком и потоковом диаметре. Для начала поместите усыпленную самку C57BL6 возрастом от шести до восьми недель на стерильный стол для вскрытия.
После промывания закрытых век с помощью PBS используйте офтальмологические ножницы, чтобы сделать разрез вдоль заднего полюса глазного яблока и аккуратно поместите изолированный глаз в чашку Петри с ледяной дополнительной гормональной эпителиальной средой. После трёхкратного промывания глазного яблока 1XPBS с добавлением 5% пенициллина стрептомицина, используйте офтальмологические ножницы и щипцы, чтобы сделать разрез от задней части роговицы к лимбу. Аккуратно отсоедините роговицу от склеры и конъюнктивы вдоль лимбальной границы, затем с помощью двух пар щипцов полностью удалите хрусталик и радужку.
После трёхкратного промывания ткани роговицы в PBS перенесите чистую ткань в новую трубку. Добавьте один миллилитр по пять миллиграмм на миллилитр раствора коллагеназы А и измельчите ткань на фрагменты размером примерно 0,5 на 0,5 миллиметра с помощью офтальмологических ножниц. Инкубировать трубку с фрагментами роговицы раствором коллагеназы А в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.
Осматривайте ткани каждые 10 минут во время пищеварения. Когда крупные фрагменты ткани не остаются, центрифугуйте образец при 300 G в течение пяти минут при комнатной температуре, затем аккуратно аспирируйте супернатант. Далее суспензируйте гранулу в 200 микролитрах раствора ЭДТА 0,25% трипсина.
Поместите трубку в инкубатор для клеточной культуры, установленный на 37 градусов Цельсия, на 10 минут, чтобы переварить оставшиеся фрагменты ткани. Наконец, используйте пипетку P1000 с широким наконечником для аккуратного тритурирования смеси и получения суспензии с одной ячейкой. Центрифугуйте суспензию клетки, как было показано ранее, и снова суспензуйте клеточную гранулу в PBS с содержанием 0,04% BSA.
При подсчёте изолированных клеток роговицы с помощью гемоцитометра было установлено, что из восьми роговиц было получено всего 1,05 умножить на 10 на мощность пяти клеток со средней жизнеспособностью клеток 94,6% и соотношением одной клетки более 96,3%, что подтверждает пригодность суспензии для последующих приложений. Иммунофлуоресцентный анализ показал, что суспензия клеток состоит из 83,5% пан-CK-положительных эпителиальных клеток, 13,5% кератокан-положительных стромальных клеток и примерно 3% клеток отрицательных по обоим маркерам. РНК, извлеченная из суспензии одной клетки, демонстрировала высокий уровень целостности РНК около 8,8 и соотношение рибосомных РНК 28S на 18S примерно 2,15, что подтверждает отличное качество РНК.
После получения отдельных клеток можно охарактеризовать функцию роговицы и исследование поверхностных отметок. Это связано с изучением взаимодействия между клетками. Одной из сложностей в этом методе является фактическое отделение роговицы от других тканей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен надежный протокол выделения высококачественных суспензий одиночных клеток из целых роговиц мыши. Метод сочетает в себе точную диссекцию тканей с последовательным ферментативным перевариванием, что позволяет получать жизнеспособные одиночные клетки, подходящие для последующего применения, такого как секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq) и проточная цитометрия. Данный протокол обеспечивает получение большого количества клеток, отличную жизнеспособность и сохранение целостности РНК, что способствует детальному анализу клеточной гетерогенности роговицы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Офтальмология
- Клеточная биология
- Одноклеточный анализ
Теоретическая часть
- Роговица представляет собой самый наружный слой глаза, имеющий ключевое значение для зрения и гомеостаза поверхности глаза.
- Секвенирование РНК единичных клеток (scRNA-seq) требует получения высококачественных суспензий из отдельных клеток.
- Ткань роговицы обладает высокой плотностью и сложной структурой, что затрудняет диссоциацию клеток.
- Существующие протоколы часто приводят к низкой жизнеспособности клеток или низкому качеству РНК.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол получения суспензий единичных клеток из интактных роговиц мыши.
- Обеспечить высокую жизнеспособность клеток и целостность РНК для последующего анализа.
- Обеспечить точную идентификацию и количественное определение основных типов клеток роговицы.
Используемые методы
- Препарирование роговиц у эвтаназированных мышей линии C57BL6.
- Последовательное ферментативное расщепление с использованием коллагеназы A и трипсина-ЭДТА.
- Механическое измельчение и осторожное тритурация для получения суспензии единичных клеток.
- Оценка жизнеспособности клеток с помощью окрашивания трипановым синим и подсчета в гемоцитометре.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание на панцитокератин (эпителиальные клетки) и кератокан (стромальные клетки).
- Анализ целостности РНК с использованием биоанализатора.
Основные результаты
- Получено примерно 1,05 × 105 клеток из восьми роговиц.
- Высокая жизнеспособность клеток (94,6%) и доля одиночных клеток (96,3%).
- Клеточный состав: 83,5% pan-CK-положительных эпителиальных клеток, 13,5% кератокан-положительных стромальных клеток, ~3% отрицательных по обоим маркерам.
- Число целостности РНК (RIN) ~8,8 и соотношение 28S/18S рРНК ~2,15, что свидетельствует об отличном качестве РНК.
Выводы
- Данный протокол позволяет стабильно получать высококачественные суспензии единичных клеток из роговиц мыши.
- Подготовленные клеточные препараты подходят для ресурсоемких последующих приложений, включая scRNA-seq.
- Этот метод облегчает детальное изучение функций клеток роговицы и межклеточных взаимодействий.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Высококачественные суспензии единичных клеток роговицы мыши необходимы для развития офтальмологических исследований на этапе поиска и обеспечения высокоразрешающего клеточного профилирования. Данный протокол решает критическую проблему подготовки жизнеспособных единичных клеток с сохранной РНК из плотной ткани глаза, что напрямую влияет на достоверность последующего анализа единичных клеток. Качественная подготовка клеток повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней и поддерживает трансляционную преемственность между этапами поиска и доклиническими исследованиями.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать клеточную гетерогенность роговицы с разрешением на уровне отдельных клеток.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет сохранения жизнеспособности клеток и целостности РНК.
- Способствует снижению механистических рисков за счет точной идентификации типов клеток.
- Повышает прогностическую достоверность при выборе офтальмологических мишеней на ранних этапах.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных суспензий одиночных клеток с высокой жизнеспособностью для разработки анализа.
- Гарантирует воспроизводимость и количественные результаты для последующего секвенирования РНК одиночных клеток.
- Подготавливает валидированный биологический материал для масштабируемых рабочих процессов скрининга.
- Позволяет проводить надежную оценку воздействия соединений на отдельные популяции клеток роговицы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует моделям, имеющим значение для изучения заболеваний, за счет сохранения естественного разнообразия клеток роговицы.
- Поддерживает качество РНК для поиска и валидации трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает поддержку принятия решений о продвижении проекта с учетом рисков за счет обеспечения непрерывности данных от этапа открытия до доклинических стадий.
- Снижает биологическую неопределенность в доклинических офтальмологических исследованиях.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол объединяет этапы раннего поиска и доклинических исследований, обеспечивая плавный переход от диссоциации тканей к анализу на уровне единичных клеток и последующим функциональным исследованиям.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей за счет обеспечения высокоточного профилирования отдельных клеток.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых количественных суспензий одиночных клеток для подготовки к анализу и скрининга соединений.
- Аналитика: предоставляет надежные показатели жизнеспособности клеток, количественную оценку типов клеток и показатели целостности РНК для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: сохраняет клеточное разнообразие и качество РНК для согласования биомаркеров и доклинической валидации.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный протокол, адаптируемый для различных программ офтальмологических исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает неопределенность механизмов при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Обеспечивает получение стандартизированных, воспроизводимых и масштабируемых препаратов единичных клеток.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в офтальмологических НИОКР.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению активов на стадии поиска и открытия.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссекции тканей глаза и методов ферментативного переваривания.
- Необходим доступ к приборам для анализа жизнеспособности клеток, иммунофлуоресценции и анализа целостности РНК.
- Требуется стандартизация между группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Метод может быть адаптирован для других типов плотных тканей при оптимизации протокола.
- Точность разделения тканей имеет решающее значение для предотвращения контаминации и обеспечения чистоты образца.
