Тест на нейтрализацию флуоресценции вируса гепатита E для измерения титра антител

Основная цель нейтрализационного теста на основе редукции флуоресценции — количественно оценить потенциал нейтрализации кандидата в вакцину и антител против HEV. Известная цитопатическая природа HEV ограничивает PRND-анализ. Этот протокол сосредоточен на иммунно-ориентированном обучении PRND, чтобы визуализировать инфицированные клетки и затем получить добычу — для начала подсчитайте свежерасщеплённые клетки HuH-7.

Затем поместите стеклянную крышку микроскопического уровня в пластину на 12 лунок и засейте 0,2 миллиона клеток в одну миллилитровую полную ДМЭМ с добавлением 10% FBS. Инкубировать клетки ночью при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. На следующий день добавьте 500 микролитров среды без сыворотки, содержащие 1,8 умножить на 10 к мощности четырёх геномных копий очищенного g1-HEV в засеянные клетки.

Инкубировать при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение одного часа. Используйте 500 микролитров DPBS, чтобы промыть клетки три раза. Добавьте два миллилитра DMEM с добавлением 2% FBS в колодцы.

Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение 72 часов. Промыйте клетки три раза с 500 микролитрами DPBS, инкубируя пять минут при комнатной температуре между каждым промывкой. Добавьте в клетки 500 микролитров 4% параформальдегида и инкубируете их при комнатной температуре в течение 20 минут.

Затем промыйте клетки DPBS, как было показано ранее. После финальной стирки инкубировать их в DPBS 30 минут при комнатной температуре. Добавьте 250 микролитров блокирующего раствора, содержащего 5% нормальной козьей сыворотки, 0,5% бычий альбумин и 0,3% тритон X100 в DPBS.

Инкубировать в шейкере в течение часа при комнатной температуре. Снимите блокирующий раствор и стирайте один раз с 500 микролитрами DPBS. Затем добавьте 250 микролитров раствора первичных антител в разбавлении 1 к 500.

Инкубировать клетки ночью при четырёх градусах Цельсия. На следующий день промыйте клетки DPBS три раза, как было показано ранее. Добавьте 100 микролитров вторичного антитела при разбавлении один к 1000 и инкубируем один час при комнатной температуре в гумифицированной камере.

Проведите инкубационный цикл стирки, как показано ранее. Добавьте 10 микролитров антифейдного реагента с DAPI на стеклянное стекло. Крепите крышку так, чтобы клетки были обращены к реактиву, избегая пузырьков воздуха.

Запечатайте покрытие покрытия лаком для ногтей, чтобы сохранить его для визуализации конфокальной микроскопии. Посчитайте свежеразделённые ячейки HuH-7. Затем поместите стеклянную крышку микроскопического уровня в пластину на 12 лунок и засейте 0,2 миллиона клеток в полном DMEM объёмом один миллилитр на каждую скважину.

На следующий день приготовьте десятикратное серийное разбавление антител к анти-ORF2 и иммуноглобулину G кролика в безсывороточных средах, с начальной концентрацией антител 25 микрограмм на миллилитр и до окончательного разведения 10 до степени минус пять. Итоговый объём разбавления должен составлять 100 микролитров. Затем добавьте 1,8 умножить на 10 к мощности четырёх копий генома очищенного g1-HEV к каждому разбавлению антител.

Инкубировать антителовирусную смесь при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение одного часа. Промой клетки 500 микролитрами DPBS. Добавьте смесь вируса антител в клетки.

Инкубировать при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа в течение одного часа. Промой клетки буфером 500 микролитров. После добавления DMEM с 2% FBS инкубировать 72 часа при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа.

Обрабатывайте клетки для иммунофлуоресцентного окрашивания, как было показано ранее. После получения флуоресцентных изображений откройте программное обеспечение ImageJ. Выберите «Файл» и откройте изображение.

Затем выберите «Изображение», «Тип» и нажмите 8-бит, чтобы преобразовать RGB-изображение в 8-битный формат. Отрегулируйте порог, выбрав Изображение и Настраивать, затем Порог, устанавливая нижний уровень на 40, а верхний — на 255. Выберите «Анализировать», «Анализировать частицы» и включить «Отобрать результаты», «Очистить», «Суммировать», «Исключить» по краям и «Составные области интереса».

Затем нажмите OK, чтобы получить количество точек флуоресцентного освещения. Вычислите процентную нейтрализацию и NT50 как антилогам к Log10 NT50, используя приведённую формулу. Постройте график, показывающий среднее и стандартное отклонение всех полей.

В инфицированных клетках был обнаружен значительный уровень рибонуклеиновой кислоты g1-HEV по сравнению с имитационными инфицированными клетками. Иммунофлуоресцентный анализ с использованием антитела к анти-ORF2 подтвердил экспрессию ORF2 в инфицированных клетках HuH-7. 50% нейтрализационный титр антитела анти-ORF2 оценивался в 2,1 умножить на 10 к степени трёх.

Репрезентативные изображения показывают появление макет-инфицированных и g1-HEV клеток HuH-7 в тесте нейтрализации редукции флуоресценции. Этот протокол позволяет исследователям изучать нейтрализационный потенциал антител к HEV и измерять их титр нейтрализации 50%. Ключевым этапом этого протокола является изоляция инфекционного вируса гепатита E, правильное окрашивание клеток и получение изображений высокого разрешения.

Альтернативные методы, такие как RT-qPCR и ELISA, могут использоваться для определения титра нейтрализации, но у них есть некоторые ограничения.