Эксперименты по иммуноокрашиванию и проникновению красителя для определения белков соединения ядра с плиссированными септатами в эмбриональном эпителии дрозофилы

Наше исследование посвящено развитию неокклюзирующих функций белков септатного соединения, с акцентом на выявление и характеристику новых компонентов, участвующих в структуре и биологических ролях. Этот протокол предназначен для характеристики организации и окклюзионной функции складчатых септатных соединений в эктодермальных эпителиях эмбрионов Drosophila. Для начала скрестите здоровых самцов и самок Drosophila соответствующих генотипов и поместите их в клетки для сбора эмбрионов с тарелками свежего яблочного сока, смазанными дрожжевым маслом.

Позвольте взрослым особям отложить оплодотворённые яйца на тарелках с яблочным соком. Вынимите пластину из клетки для сбора яиц и выдержите эмбрионы в течение 13–16 часов после откладывания при температуре 25 градусов Цельсия, чтобы достичь стадии 16. Затем закрепите эмбрионы 16-й стадии в соответствующем фиксирующем растворе и проведите иммунокрашивание с нужными антителами.

Для наилучшего результата сфотографируйте эмбрионы на конфокальном микроскопе с объективом масляного погружения 40x. После фокусировки на интересуемом эмбрионе установите интенсивность и усиление лазера так, чтобы добиться сильного флуоресцентного сигнала без перенасыщения пикселей. Определите эмбрионы 16-й стадии, которые не экспрессируют зелёный флуоресцентный белок, кодируемый балансировщиком, используя морфологию среднего кишечника.

Сфокусируйте сканирование на слюнной железе или заднем кишечнике и расположите Z-скан так, чтобы включать максимально возможный диаметр просвета, чтобы визуализировать всю латеральную мембрану эпителиальной клетки. Установите подходящую среднюю линию и сфотографируйте поляризованную ткань как минимум в 20 контрольных и 20 эмбрионах Cora 4 мутантных стадии 16. Записывайте данные только с эмбрионов, у которых маркер соединения соединения плотно локализован в апикально-латеральной области мембраны.

В эмбрионах дикой стадии 16 оценивают обогащение белков соединения с плиссированными септатами вдоль апикальной области латеральной мембраны возле соединения с адгеренами. Зафиксируйте устойчивое распределение маркера соединения с плиссированной перегородкой по всей латеральной мембране у мутанта. Создайте свежий раствор красителя, растворив родамино-маркированный 10 килодальтон-декстран до 1 миллиграмма на миллилитр в 0,5-молярном натриевфосфате при pH 7,5 с 5 миллимолярными хлоридом калия.

Используя игольчатый механизм, втяните капиллярную трубку наружного диаметра 1 миллиметра и внутреннего диаметра 0,5 миллиметра с волокном в стеклянную иглу. Затем загрузите стеклянную иглу в держатель иглы на микроманипуляторе и разместите микроманипулятор рядом с перевёрнутым микроскопом. Ориентируйте иглу как можно ближе к параллельному стеклу микроскопа и опустите её в ту же Z-плоскость, что и боковая часть затвора.

Сломайте кончик иглы, ударив ею по стенке стекла микроскопа. Поднимите иглу выше уровня затвора и снимите её для загрузки. Далее заполните капиллярную трубку красителем с помощью самого маленького доступного наконечника пипетки.

Перезарядьте заполненную иглу в держатель для иглы. Проверьте поток декстена на 10 килодальтон, введя небольшое количество в каплю галоуглеродного масла на поверхности стекла микроскопа. Используя накладку толщиной 22 x 22 миллиметра, создайте вмятинную линию на тарелке с яблочным соком.

Выровняйте примерно по 25 эмбрионов контроля и мутанта Cora 4 на стадии 16 или 17 на тарелке с яблоковым соком. Убедитесь, что их задние концы совпадают вдоль линии, а вентральные поверхности обращены вверх. Затем прикрепите кусок двусторонней ленты к скользящей крышке номер 2 размером 22 x 22 миллиметра.

Прикоснитесь лентой к линии эмбриона и слегка потерете крышку, чтобы перенести эмбрионы с пластины на двустороннюю ленту. Далее добавьте каплю галоуглеродного масла к стеклу микроскопа и прикрепите крышку к затвору, позволяя капиллярному действию создать связь. Ориентируйте крышку ближе к стороне горки, напротив любой заматированной части.

Высушите эмбрионы в течение трёх-пяти минут в контейнере с осушителем и полностью покройте их галоуглеродным маслом. Крепите затвор с эмбрионами на перевёрнутый микроскоп так, чтобы эмбрионы были обращены вверх и в сторону от объектива. Выровнять микроманипулятор так, чтобы игла была обращена к заднему концу эмбрионов под углом, максимально параллельным эмбриону, и отрегулировать ось Z так, чтобы кончик иглы совпадал с серединой эмбриона вдоль дорсально-вентральной оси.

Далее вводите эмбрионы, быстро перемещая стадию в иглу так, чтобы кончик иглы вошёл в гемокоэль. Введите примерно 0,2–0,5 нанолитра красителя с помощью шприца объемом 10-25 или 50 миллилитров. Быстро вынимите иглу и переместите стадию на следующий эмбрион для инъекции красителя.

Затем добавляйте дополнительное галоуглеродное масло поверх эмбрионов. Накройте эмбрионы накрышкой 22 x 22 миллиметра, чтобы создать равномерный масляный слой между шлейками и предотвратить сжатие. Проведите визуализацию на флуоресцентном соединенном микроскопе или конфокальном микроскопе после инъекции декстран-красителя.

На конфокальном микроскопе проведите Z-стек примерно на четверть глубины эмбриона вдоль дорсально-вентральной оси, чтобы оценить просвет трахеи. Осмотрите просвет трахеи, слюнной железы или заднего кишечника на предмет накопления меченного декстрана. Запишите генотип и стадию развития каждого эмбриона, а также накапливается ли маркированный декстран в каком-либо трубчастом органе.

Обратите внимание на эмбрионы, у которых перивителлиальное пространство сильно окрашено красителем, так как это может быть случайное введение в это пространство. В эмбрионах дикого типа макроглобулин-комплемент, или Mcr, был равномерно локализован вдоль латеральной мембраны на 13-й стадии, обогащался в апикальной области латеральной мембраны на 14-й стадии и был сильно локализован в апикально-латеральной области, непосредственно базально от соединения адгеренов к 16-й стадии. Окрашивание кортикальных антител определило зрелые плиссированные септатные соединения в эмбрионах 16-й стадии дикого типа, аналогично Mcr.

У эмбрионов Cora 4 Mcr не смог достичь сильной апикальной локализации к 16-й стадии и оставался распределенным вдоль латеральной мембраны. Локализация E-cadherin была схожа у эмбрионов дикого типа и Cora 4 мутантов стадии 16. В эмбрионах дикой стадии 17, которым вводили родамино-маркированный декстран 10 килодальтон, краситель окружал трахею, но не проникал в просвет.

У эмбрионов Cora 4 мутантной стадии 17 краситель накапливался в просвете трахеи в течение 10 минут после инъекции. Этот протокол позволяет исследователям уверенно определить, кодирует ли ген ядро или вспомогательный компонент складчатых септатных соединений в эмбриональных тканях дрозофилы. Стадия эмбриона крайне важна при выполнении этой техники, так как для этого требуется 16-я стадия.

Септатные соединения созревают со временем, пока полностью не закрепятся на 16-й стадии. Мы считаем, что этот протокол может быть эффективно реализован в открытом генетическом скрининге с использованием РНК-интерференционных линий для выявления новых генов соединения с плиссированными септатами.