Фенотипическое профилирование поведенческих фенотипов, вызванных МПТП, похожих на паркинсонианский синдром, у личинок данио-рерио, на основе поведенческого эксперимента

Мы представляем мультипараметрический протокол поведения для комплексного профилирования моторных и немоторных фенотипов паркинсона у личинок данио-рерио. Этот протокол применяется к моделированию болезни Паркинсона, скринингу лекарств, экологической нейротоксичности, исследованиям с использованием личинок рыб. Для начала носите соответствующие средства индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и защитные очки.

Разбавьте 100x E3 в соотношении один к 100 сверхчистой водой, чтобы подготовить материал с одной прочностью. Теперь выберите взрослых самцов и самок данио-рерио. Используя резервуары для разведения с съёмными разделителями, проводите контролируемое разведение.

В 20:00 разместите самцов и самок данио-рерио в отдельные секции размножающихся аквариумов в соотношении двух самцов к трём самкам, используя разделители, чтобы держать их на расстоянии. На следующее утро в 8:00 уберите перегородки, чтобы разрешить спаривание. Соберите эмбрионы через час и трижды промой их чистой системной водой.

Эмбрионы помещают в чашки Петри диаметром 100 миллиметров, содержащие 20 миллилитров свежей среды E3. Затем инкубировать эмбрионы при 28 градусах Цельсия в 14-часовом световом и 10-часовом тёмном цикле. На следующий день после оплодотворения аккуратно удаляйте неоплодотворённые, деформированные и аномальные эмбрионы с помощью пастбищной пипетки.

Аспирируйте среду медленно от края чашки Петри и добавляйте свежую эмбриональную среду E3 вдоль стенки чашки Петри, чтобы минимизировать беспокойство для эмбрионов дикого типа. Для группы, обработанной MPTP, используйте раствор MPTP на 50 микромоляров. Через четыре дня после удобрения модифицируйте пастбищную пипетку объемом 3 миллилитра, отрезав 10 миллиметров от кончика для создания широкого отвора.

В 18:00 используйте модифицированную пипетку, чтобы выбрать личинки данио-рероа из каждой группы и переместить по одной личинке на каждую скважину в пластину на 96 луц. Осмотрите каждую скважину под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что каждая личинка данио-рероа выглядит здоровой. Проверьте, что плавники открыты и регулярно качаются, тело вертикально, а плавательная лестница надувана.

Затем аккуратно очистите нижнюю часть пластины, чтобы грязь не повлияла на результаты видеозаписи. Затем переместите 96-ядровую пластину по центру в нижнюю часть камеры zebra box. Выберите режим квантования в программном обеспечении для отслеживания видео.

Для мониторинга регуляции бодрствования во сне настройте регулировку света так, чтобы выключать свет в 22:00 и включать в 8:00 утра. Настройте программные параметры так, чтобы порог обнаружения был установлен на 40, вспышка — на 25, заморозка — на четыре, общее время мониторинга — на 52 часа, а затем — на 60 секунд. Начните процедуру пробуждения во сне в 8:00 PM.To следите за фотомоторными реакциями, помещайте личинки через пять дней после оплодотворения в пластину на 96 лунок с одной личинкой в каждом. Затем установите программу перехода света на 0–60 секунд темноты, затем 60–120 секунд постоянного света.

Запускайте протокол и собирайте параметры движения каждые шесть секунд на протяжении 120-секундного анализа. Остановите протокол на 120 секундах и экспортируйте файл данных. Затем поместите личинок в полную темноту на пять минут, чтобы акклиматизировать их к последующему анализу тёмного стробоскопического света.

Настройте программу перехода света так, чтобы стробоскоп подавал на частоте 10 герц в течение 60 секунд. Для оценки тигмотаксиса выберите две пластины с шестью ямеками. Заполните каждую ямочку четырьмя миллилитрами среднего вещества E3.

Через пять дней после оплодотворения соберите личинки данио-рерио из группы дикого типа и группы, обработанной MPTP, и поместите их в отдельные шесть колодцевых пластин. Перед оценкой тигмотаксиса поместите пластины скважины в коробку зебры на 15 минут для акклиматизации. Затем используйте функцию площади рисования, чтобы нарисовать два концентрических круга в каждой яме с радиусом внутренней окружности, равной половине радиуса ямы, и начать оценку.

Для оценки движения перенесите личинки данио-рерио, которым пять дней, из группы дикого типа и группы, обработанной MPTP, в две отдельные пластины по 12 колодцах. После 15-минутной акклиматизации выберите режим онлайн-анализа отслеживания и записывайте двигательную активность в течение пяти минут с помощью автоматизированной системы видеоотслеживания. Для теста на реакцию на испуг пересадите личинки возрастом пять дней по отдельности в две пластины с 12 лунками, по одной личинке в каждую и двумя миллилитрами среды E3.

Поставьте тарелки в коробку Zebra для пяти минут лёгкой адаптации. Запустите программное обеспечение ZebraLab и активируйте онлайн-режим анализа отслеживания. Откройте интерфейс светового триггера, затем выберите один из трёх приведённых ниже методов триггера и включите усиленные стимулы.

Затем установите стартовый метод на момент начала сессии. В расписании переходов определите ритм тёмной вспышки. Установите программу на срабатывание через 21 секунду, затем установите переход с одной на пять миллисекунд с 100% интенсивностью света.

Переход от двух к 2, 890 миллисекунд при 100% интенсивности света. Переход от трёх до пяти миллисекунд с 0% интенсивности света и перехода от четырёх до 100 миллисекунд при 0% интенсивности света. Поставьте галочку для повторного списка переходов, чтобы обеспечить периодическую прошивку, а затем запустите протокол.

Для теста в светло-тёмном испытании переложите личинок данио-рерио в две пластины по 24 ямы, по одной личинке в каждую и один миллилитр среднего витамина E3. После пяти минут адаптации в коробке зебры включите онлайн-режим анализа отслеживания. Затем настройте программу света на шесть минут постоянного освещения, а затем четыре минуты полной темноты.

На 10-й минуте прекратите запись поведения и сохраняйте данные. Аккуратно снимите пластину из коробки с зеброй. После каждого поведенческого эксперимента распыляйте и протирайте все контактные поверхности с MPTP свежеприготовленным раствором гипохлорита натрия.

Собирайте жидкие и твердые отходы, содержащие MPTP, и чётко обозначайте их как опасные нейротоксичные отходы. Обрабатывайте все загрязнённые материалы свежеприготовленным раствором гипохлорита натрия. Обработанные личинки данио-рерио демонстрировали нарушения сна и бодрствования по сравнению с дикой группой.

Общее время сна также значительно увеличилось в лечебной группе. Количество случаев ночёвки в лечебной группе значительно сократилось, а средняя продолжительность ночёвки увеличилась. Активность бодрствования и средняя активность были значительно снижены в лечебной группе.

При постоянном освещении индекс замерзания в обработанной группе значительно повышался. Он также значительно увеличивался при стимуляции стробоскопом на частоте 10 герц. Кривые фотомоторного ответа показали сниженную реактивность в рассматриваемой группе.

Результаты отслеживания показали снижение локомоторного и исследовательского поведения в группе. Общее плавание и средняя скорость плавания также значительно снизились в обработанной группе. Коэффициент времени замерзания был значительно выше в обработанной группе, но коэффициент быстрого перемещения был значительно ниже.

Чередующиеся переходы светлого и тёмного приводили к выраженным пикам скорости у диких личинок. Расстояние проплывания после стимуляции и пиковая скорость после стимуляции значительно снизились в лечебной группе. Задержка начала движения с пиковой скоростью также была значительно задержана в обработанной группе.

Ключевая задача — минимизировать внутренние детерминанты с учётом индивидуальной вариабельности для обеспечения точного и воспроизводимого анализа поведения на уровне данио-рерио. Поведенческая кластеризация и феномическое профилирование могут применяться для выявления тонких нейротоксичных эффектов и получения более глубоких магнитных инсайтов. Будущие исследования могут применить эту платформу для одобренного скрининга лекарств на опасность и фармакологической оценки в моделях болезни Паркинсона.