Извлечение короткоцепочечных жирных кислот из мышиных фекалий с использованием двухфазного кислотно-растворительного метода
17 июля 2026 г.
Этот протокол описывает двухфазный метод экстракции кислотой и растворителем для выделения короткоцепочечных жирных кислот из образцов мышиных фекалий с низким входом без дериватизации.
Этот протокол позволяет извлекать короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA) из образцов мышиных фекалий с низким уровнем входа для рутинного анализа на основе газовой хроматографии. SCFA, включая ацетат, пропионат и бутират, производятся микробиотой кишечника путём ферментации пищевых волокон. Они широко изучены, поскольку связаны с поведенческими, метаболическими и физиологическими фенотипами.
Однако количественная оценка SCFA в фекальных образцах остаётся сложной. Эти метаболиты являются летучими, часто присутствуют на низких уровнях и измеряются в сложных биологических матрицах. В исследованиях на мышях количество фекалий, собранного у каждого животного, также часто ограничено.
Стандартные методы могут требовать дериватизации, относительно больших объёмов выборок или специализированного оборудования. Здесь представлен двухфазный процесс экстракции кислотным растворителем с использованием разбавленной соляной кислоты и этилацетата для извлечения SCFA из образцов мышиных фекалий с низким входом в формате, совместимом с рутинным анализом GC. Итак, мы начинаем с правильной компоновки, чтобы продолжить остальную часть протокола.
Далее у нас есть коробка для образцов с правильно подписанными образцами замороженных фекалий. Далее мы установили нашу пипетку на 1000 микролитров на 255. Теперь у нас есть разбавление с маркировкой HCl.
Мы продолжаем распределять HCl в каждый из наших образцов. Теперь мы добавляем этанол в чистящий отсек для пинцета. Теперь мы используем тот же этанол, чтобы сделать ванну для наших пестиков.
Теперь мы берём образцы фекалий и кладём их в флаконы с центрифугами. Теперь мы используем наши чистые пестики, чтобы измельчить каждый образец фекалий в соответствующих флаконах для центрифуг. Мы берём образцы и прикладываем их к вихрю минимум 10 секунд или пока они полностью не смешаются.
Мы приносим смешанные образцы в нашу центрифугу и устанавливаем её. Обеспечьте правильный баланс центрифуги. Установите центрифугу на 16 000 раз на g на 10 минут при 4 градусах Цельсия.
Через 10 минут снимите образцы из центрифуги. Переименуйте новые флаконы центрифуг в соответствии с вашими образцами. Установите пипетку на 200 микролитров на 120.
Аккуратно снимите супернатант, стараясь не трогать гранулу. Переложите супернатант в новые соответствующие флаконы. Вы можете выбросить гранулу.
Добавьте столько же этилацетата в новые флаконы. Верните эти образцы в центрифуга. Установите центрифугу на 2 374 g на 20 минут при 4 градусах Цельсия.
Через 20 минут снимите образцы. Переименуйте новые флаконы центрифуг в соответствии с вашими образцами. Установить пипетку обратно на 120 микролитров.
Осторожно, чтобы не касаться нижнего слоя, снимая только верхний. Перенесите супернатант в новые флаконы с правильной маркировкой. Перенесите эти образцы в коробку для хранения до дальнейшего анализа.
Наконец, поставьте пробную коробку в морозильник с отрицательной температурой 80 градусов Цельсия. Извлеченные аликвоты SCFA, по 120 микролитров каждая, хранились при минус 80 градусах Цельсия до количественной оценки с помощью газовой хроматографии. Количественный анализ выявил восемь SCFA, включая ключевые метаболиты: уксусную, пропионовую кислоту и масляную, как показано на рисунке.
Для подтверждения изоляции SCFA данные газовой хроматографии оценивались с помощью тестов восстановления и воспроизводимости. Восстановление оценивалось путём подъёма контрольных образцов с известными концентрациями внутреннего стандарта, тогда как воспроизводимость подтверждалась повторными анализами в течение и в течение нескольких дней. В итоге, этот протокол обеспечивает рабочий процесс для извлечения SCFA из образцов мышиных фекалий с низким уровнем входа.
Он не требует дериватизации и совместим с рутинным анализом на основе GC. Этот метод поддерживает измерение каловых SCFA в различных моделях мышей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол экстракции короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) из образцов фекалий мышей с низким содержанием биоматериала с использованием метода двухфазной кислотно-органической экстракции. Подход оптимизирован для малых объемов образцов и совместим со стандартным лабораторным оборудованием, что позволяет эффективно подготавливать пробы для анализа методом газовой хроматографии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Аналитическая химия
- Метаболомика
- Исследования микробиома
Теоретическая часть
- Краткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) представляют собой важные микробные метаболиты в кишечнике, выполняющие значимые биологические функции.
- Точное количественное определение КЦЖК в небольших образцах фекалий является сложной задачей при исследованиях на мелких животных.
- Существующие методы экстракции могут требовать дериватизации или использования больших объемов образцов.
- Существует потребность в стандартизированных и эффективных протоколах, совместимых с рутинными аналитическими процессами.
Цель исследования
- Разработка протокола экстракции короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) из индивидуальных образцов фекалий мышей массой 20–50 mg.
- Обеспечение разделения фаз без дериватизации с использованием разбавленной соляной кислоты и этилацетата.
- Обеспечение совместимости с анализом методом газовой хроматографии.
Используемые методы
- Гомогенизация фекалий
- Подкисление разбавленной соляной кислотой
- Разделение органическими растворителями с использованием этилацетата
- Низкотемпературное центрифугирование
- Использование стандартного лабораторного оборудования
Основные результаты
- Успешное извлечение основных КЦЖК (ацетата, пропионата, бутирата) из отдельных образцов фекалий мышей.
- Четкое разрешение пиков КЦЖК при характерных временах удерживания выше уровня фонового шума.
- Протокол эффективен для образцов с низким содержанием аналита и совместим со стандартными платформами для газовой хроматографии.
Выводы
- Данный протокол представляет собой стандартизированный рабочий процесс экстракции SCFA из ограниченного количества фекального материала.
- Он позволяет решить процедурные трудности, возникающие при исследованиях на мелких животных.
- Метод обеспечивает надежный последующий анализ SCFA с использованием стандартного лабораторного оборудования.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость
Стандартизированная экстракция короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) из образцов фекалий мышей с низким содержанием биоматериала позволяет устранить критическое ограничение в исследованиях микробиома и доклинической метаболомике. Данный протокол обеспечивает надежное количественное определение КЦЖК с помощью рутинной газовой хроматографии, что способствует проведению трансляционных исследований, связывающих метаболиты кишечной микробиоты с биологией организма хозяина. Этот метод повышает достоверность прогностических данных на ранних этапах поиска и облегчает сопоставимость результатов различных исследований в рамках портфелей корпоративных НИОКР.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Обеспечивает надежное измерение короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК), вырабатываемых в кишечнике, для проведения микробиомных исследований на основе выдвинутых гипотез.
- Поддерживает функциональную валидацию метаболических путей микробиоты в моделях, релевантных конкретным заболеваниям.
- Способствует снижению механистических рисков путем получения количественных данных о метаболитах.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет готовить стандартизированные биологические экстракты, совместимые с рабочими процессами высокопроизводительной газовой хроматографии.
- Повышает воспроизводимость и сопоставимость анализов при работе с доклиническими образцами с низким содержанием биоматериала.
- Обеспечивает надежный скрининг воздействий, модулирующих продукцию SCFA.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласует количественное определение метаболитов со стратегиями трансляционных биомаркеров на моделях мелких животных.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации вмешательств, направленных на микробиом.
- Снижает риск аналитической вариабельности при проведении межисследовательских и многоцентровых работ.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол экстракции применим на всех этапах — от первичного поиска до доклинических исследований, обеспечивая количественный анализ SCFA при ограниченном объеме биологического материала и создавая базу для последующего изучения биомаркеров и механизмов действия.
- Фундаментальная биология: обеспечивает стандартизированный рабочий процесс для проверки гипотез и исследования метаболических путей в исследованиях микробиома.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные измерения SCFA, подходящие для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: позволяет получать четкие хроматографические пики для сравнительного анализа экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: способствует согласованию доклинических данных о метаболитах с целями поиска трансляционных биомаркеров.
- Корпоративное использование: предлагает широко применимый метод экстракции для различных исследований микробиома и метаболомики.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозирования взаимосвязей между микробиомом и метаболитами, а также точность валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует процессы экстракции и анализа в различных исследованиях, повышая воспроизводимость и масштабируемость.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении программ, направленных на изучение микробиома, и снижает аналитические риски на поздних этапах.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации активов по поиску новых лекарств на основе микробиома и метаболитов с учетом скорректированных рисков.
Рекомендации по реализации
- Требуются навыки гомогенизации образцов и анализа методом газовой хроматографии.
- Используется стандартное лабораторное оборудование и рутинная аналитическая инфраструктура.
- Необходимо строгое соблюдение стандартизированных протоколов экстракции и анализа всеми участниками исследования.
- Метод применим для различных моделей мелких животных и при ограниченном объеме исходного материала.
- Эффективность экстракции и пределы обнаружения должны быть валидированы для каждого конкретного экспериментального контекста.
