Функциональная оценка эпителиального барьера десневой кости мыши с помощью флуоресцентных трассеров
27 февраля 2026 г.
Цель этого протокола — предоставить стандартизированный подход к количественной оценке целостности эпителиального барьера мышиных десен путем местного нанесения флуоресцентно-маркированного декстранса различных молекулярных размеров на поверхность дессен in vivo, а затем проведения ex vivo визуализации с использованием однофотонной микроскопии.
Это стандартизированный протокол для количественной оценки целостности эпителиального барьера десна. Этот протокол полезен для изучения болезней барьерной дисфункции и тестирования восстановительных барьерных препаратов в десенах. Для начала разделите самцов мышей дикого типа C57BL/6J на три группы: необработанную контрольную группу, группу пародонтита, вызванную лигированием, и группу пародонтита, индуцированного Porphyromonas gingivalis.
Выберите флуоресцентные трассеры с неперекрывающимися спектрами, такие как декстран с маркировкой FITC и родамин B с маркировкой декстран. Чтобы разбавить трассеры, смешайте по одному грамму на литр FD40 и RD70 в 2% карбоксиметилцеллюлозном геле. Храните приготовленную смесь на льду.
После подтверждения глубины анестезии с помощью рефлекса сжатия пальцев, используйте кляп для рта, чтобы удерживать ротовую полость мыши открытой. Нанесите 50 микролитров подготовленной трассерной смеси местным образом на поверхность губных десен молярной области. Оставьте смесь на 30 минут и наносите снова, если проглотите.
После 30 минут нанесения трассера закрепите мышь в положении на спине на картоне и закрепите конечности скотчем, чтобы обездвижить животное. Затем откройте ротовую полость усыпленной мыши и изолируйте верхнюю челюст. Аккуратно уберите окружающие ткани и тщательно прополосните образец PBS.
Разместите изолированную верхнечелюстную колюсть на стеклянном затворе. Затем положите глину для моделирования с обеих сторон, чтобы стабилизировать и закрепить крышку на образце. Аккуратно размещайте расчленённую верхней челюсть на специально разработанный держатель для образцов, чтобы обеспечить стабильное расположение для визуализации.
Использование вертикального однофотонного микроскопа с объективом погружения в воду 25x. Сосредоточьтесь на закреплённой области под верхней челюстью и сделайте снимки. Выберите интересующую область на щечной поверхности второго моляра внутри верхней челюсти и немедленно начните визуализацию.
Получите изображения в Z-стеке с шагом в один микрометр, начиная от поверхности десен до глубины от 100 до 200 микрометров для трёхмерной реконструкции. В программе нажмите «Файл» и выберите новую папку, чтобы создать новую папку для набора данных и присвоить описательное имя. Во вкладке «захват» установите формат XY на 512 на 512 с разрешением 0,99 микрометра на пиксель.
Затем установить коэффициент увеличения на единицу. Далее установить длины волн возбуждения на 488 нанометров и 561 нанометр. Настройте окна излучения на 500–550 нанометров и от 570 до 620 нанометров соответственно.
Для серии Z и трёхмерной визуализации выберите режим получения ND. Установите шаг Z на один микрометр и при необходимости отрегулируйте. После настройки параметров выберите режим live, чтобы визуализировать область десни в отдельных и объединённых люоресцентных каналах.
Затем нажмите «запустить сейчас», чтобы начать сбор изображений. Для измерения проницаемости разделите флуоресцентную интенсивность FD40 и RD70 на разные каналы. Объедините срезы по оси Z без фонового вычитания.
Затем используйте программное обеспечение ImageJ для количественной оценки интенсивности флуоресценции и оценки проницаемости эпителиального барьера. Нажмите «Файл» и выберите «Открыть», чтобы открыть изображение верхней челюсти в ImageJ. Затем нажмите изображение и измените тип изображения на 8-битный формат для анализа.
Нажмите «Анализировать», выберите «Набор измерений». Затем проверьте площадь, среднюю и интегрированную плотность и нажмите OK, чтобы подтвердить. Затем выберите желаемый канал и отрегулировав порог, кликнув на изображение, выбрав настройки и порог.
Включите опцию тёмного фона, чтобы учесть чёрный фон. Нажмите «Анализировать» и выберите «набор измерений». Затем проверьте среднее значение серого и предел порога, и подтвердите, нажав OK.
С помощью инструмента свободного выбора вручную обведите контур области флуоресцентного сигнала на стороне дессенной ткани. Нажмите «Анализируй» и выберите меру, чтобы получить значения интенсивности флуоресценции, где интегрированная плотность соответствует интенсивности флуоресценции. Скопируйте результаты измерений в таблицу для расчётов и построения графиков.
Вычислите среднюю интенсивность флуоресценции контрольной группы в таблице. Разделите значение интенсивности флуоресценции каждой экспериментальной группы на среднее по контрольной группе, чтобы получить относительную интенсивность флуоресценции. В контрольной группе оба флуоресцентных трассера в основном были ограничены поверхностью десна.
В группах с лигированием и Porphyromonas gingivalis наблюдалось значимое экстравазирование как FD40, так и RD70 в десневой эпителий. Полуколичественный анализ показал значительное увеличение интенсивности флуоресценции как FD40, так и RD70 в группах с лигированием и Porphyromonas gingivalis. 3D-визуализация показала более обширное и диффузное распределение флуоресценции трасеров вокруг десневой сосудистой системы в группах, обработанных с Porphyromonas gingivalis, по сравнению с контрольными группами.
Этот протокол количественно оценивает проницаемость и целостность парацеллюлярного барьера десневой вады мышей. Этот протокол может сочетаться с микро-КТ для мультимодального анализа изображений. Дальнейшие исследования могут рассмотреть препараты для восстановления барьеров и молекулярные механизмы при заболеваниях полости рта.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Эпителиальный барьер десны служит критически важным рубежом первой линии защиты в обеспечении иммунитета и гомеостаза полости рта. Целостный эпителиальный барьер эффективно предотвращает проникновение вредных веществ из ротовой полости, в то время как его нарушение тесно связано с патогенезом таких состояний, как периодонтит и красный плоский лишай полости рта. В данной работе мы разработали метод оценки целостности эпителиального барьера десен у мышей на основе местного применения препаратов. Сначала смесь флуоресцентно меченных декстранов с различной молекулярной массой (40 или 70 kDa) в 2% растворе карбоксиметилцеллюлозы натрия наносилась местно на поверхность губной десны в области моляров. После инкубации в течение 30 мин верхняя челюсть была выделена и зафиксирована в специальном держателе для немедленной визуализации с использованием системы однофотонной микроскопии. Данный подход позволяет визуализировать и количественно определить трейсеры разных размеров в эпителиальных слоях, обеспечивая функциональный показатель целостности эпителиального барьера десны, который может быть применен в исследованиях воспаления полости рта, заживления ран и моделирования заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология полости рта
- Иммунология
- Функция эпителиального барьера
Теоретические основы
- Десневой эпителиальный барьер является важнейшим рубежом защиты в системе иммунитета и гомеостаза полости рта.
- Целостный эпителиальный барьер предотвращает проникновение вредных веществ из полости рта.
- Нарушение целостности десневого эпителиального барьера связано с развитием периодонтита и красного плоского лишая полости рта.
- Функциональная оценка целостности барьера необходима для изучения воспалительных процессов в полости рта, заживления ран и моделирования заболеваний.
Цель исследования
- Разработка метода местного применения для оценки целостности эпителиального барьера десны у мышей.
- Обеспечение возможности визуализации и количественного анализа трейсеров с различной молекулярной массой при их прохождении через эпителиальные слои.
- Предоставление функционального показателя целостности барьера, применимого к моделям заболеваний полости рта.
Используемые методы
- Местное нанесение флуоресцентно меченных декстранов (40 или 70 kDa) в 2% растворе карбоксиметилцеллюлозы натрия на поверхность вестибулярной десны.
- 30-минутный период инкубации для обеспечения проникновения маркера.
- Диссекция и фиксация верхней челюсти в специализированном держателе.
- Визуализация с использованием системы однофотонной микроскопии.
- Количественная оценка проникновения маркера через эпителиальные слои для анализа целостности барьера.
Основные результаты
- Данный метод позволяет визуализировать и количественно оценить распределение флуоресцентных декстранов различных размеров в слоях десневого эпителия.
- Проникновение маркера служит функциональным показателем целостности барьера десневого эпителия.
- Этот подход применим для исследований воспаления в полости рта, заживления ран и моделирования заболеваний.
- Нарушение барьера может быть выявлено по усилению проникновения маркера.
Выводы
- Метод местного нанесения с использованием флуоресцентных декстранов позволяет провести функциональную оценку целостности барьера эпителия десны у мышей.
- Данный подход представляет собой ценный инструмент для изучения иммунитета полости рта, дисфункции барьера и связанных с этим патологий.
- Метод подходит для применения при изучении воспалений в полости рта, заживления ран и моделирования заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Эпителиальный барьер десны служит важнейшим рубежом защиты в системе иммунитета полости рта, и его нарушение связано с воспалительными заболеваниями полости рта, такими как периодонтит. Данный метод обеспечивает функциональный количественный анализ целостности барьера с помощью проникновения трейсеров разного размера, что позволяет снизить механистические риски в моделях заболеваний полости рта. Он поддерживает валидацию мишеней и разработку анализов для терапии, направленной на слизистый иммунитет и заживление ран.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с функцией эпителиального барьера в иммунитете полости рта.
- Практическая ценность: обеспечивает количественную оценку селективной по размеру проницаемости для функциональной валидации мишеней, участвующих в регуляции барьера.
- Прогностическая ценность: способствует доклиническому отбору соединений, дифференцируя те, которые сохраняют или восстанавливают целостность барьера, от тех, которые увеличивают проницаемость.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Представляет функциональный анализ для оценки селективности барьера с использованием флуоресцентных декстранов с определенной молекулярной массой (40 или 70 kDa).
- Практическая ценность: Обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую количественную оценку проникновения маркера через эпителиальные слои для скрининга соединений.
- Готовность метода: Способствует разработке достоверных количественных показателей для исследований проникновения и удерживания веществ в слизистой оболочке полости рта.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между оценкой барьерной функции на этапе фундаментальных исследований и доклиническими моделями воспаления в полости рта и заживления ран.
- Релевантность заболеваниям: имеет прямое применение при моделировании периодонтита и красного плоского лишая, при которых нарушение барьерной функции является ключевым патогенетическим механизмом.
- Оптимизация прогресса с учетом рисков: позволяет проводить лонгитюдный мониторинг заживления или восстановления барьера в ответ на терапевтические вмешательства.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, позволяя проводить раннюю оценку функции слизистого барьера перед переходом к исследованиям эффективности и безопасности на моделях заболеваний полости рта.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о регуляции эпителиального барьера и иммунном гомеостазе в полости рта.
- Разработка методов анализа: Позволяет получать количественные данные визуализации проникновения трейсеров, что способствует анализу зависимости «структура — активность».
- Аналитика: Предоставляет измеримые данные о проницаемости в зависимости от размера частиц, что позволяет сравнивать условия тестирования и эффекты соединений.
- Трансляционные исследования: Связывает функциональную оценку барьера с доклинической валидацией на моделях повреждения и восстановления слизистой оболочки полости рта.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для оценки доставки через слизистую оболочку, удержания и действия агентов, модулирующих барьер, в рамках различных программ НИОКР в области стоматологии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения неоднозначности механистических связей между барьерной функцией и патологией полости рта.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированный, совместимый с методами визуализации рабочий процесс с количественными результатами для кросс-функциональных групп.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления соединений, которые нарушают или восстанавливают целостность десневого барьера.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию средств для терапии заболеваний полости рта с учетом рисков на основе функциональных показателей барьера.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с тканями полости рта, приготовления флуоресцентных трейсеров и проведения однофотонной микроскопии.
- Результат зависит от наличия микроскопических систем, способных визуализировать проникновение трейсера через эпителиальные слои.
- Для получения воспроизводимых результатов необходима стандартизация концентрации трейсера, времени инкубации и фиксации тканей.
- Адаптация к моделям ex vivo или моделям других видов может потребовать оптимизации средства доставки и параметров инкубации.
- Практические ограничения включают жизнеспособность тканей после диссекции и возможную вариабельность доступности поверхности десны.
