Сверхразрешающая визуализация и совместное управление: протокол для конфокальной микроскопии с мультиплексным обнаружением
February 24th, 2026
Этот протокол подробно описывает передовые применения визуализации и управление совместными ресурсами системы лазерно-сканирующего конфокального микроскопа, интегрированной с мультиплексированным детектором массива для высокоразрешающей клеточной и субклеточной визуализации. Рабочий процесс позволяет мультимодальное изображение от конфокального до сверхразрешения (~120 нм) на одной платформе, делая визуализацию наномасштабов более доступной.
Наши исследования сосредоточены на разработке доступных методов сверхразрешающей визуализации динамических субклеточных структур, преодолевая дифракционные пределы традиционной микроскопии. Метод сверхразрешения охватывает фототоксичность, сложную работу и специализированную подготовку. Этот протокол снижает эти барьеры с помощью конфокального мультиплексного обнаружения.
Для начала включите основной блок микроскопа, лазерный пусковой модуль, светодиодный источник света и управляющий компьютер. Запускайте операционное ПО микроскопа. С основного интерфейса выберите GFP, затем отключите отражённый свет.
Перейдите к панели приобретений. В выпадающем меню объектива выберите соответствующую объективную линзу. Для живой клеточной визуализации за 45–60 минут до съёмки активируйте камеру окружающей среды и систему активной стабилизации фокуса.
После стабилизации системы проверьте устойчивость с помощью датчиков камеры. Нанесите иммерсионное масло на переднюю линзу объектива, не появляя пузырей. Поместите подготовленный образец на стадию микроскопа.
Аккуратно поднимайте его, пока крышка не соприкоснется с погружным маслом. Далее откройте программное обеспечение для приобретения. Перейдите на вкладку «Приобретение» и выберите «создать новый эксперимент».
Теперь добавьте изображения для используемых флуорофоров. Для каждой дорожки установите диаметр конфокального отверстия на один воздушный блок. Для оптимизации мощности лазера выберите первый канал и переключитесь в режим живого сканирования.
Установите начальную мощность лазера на низкое, затем установить усиление детектора на умеренный уровень в его линейном диапазоне. После этого постепенно увеличивайте мощность лазера, пока целевые структуры не станут чётко видимы на фоне на живом изображении. Настройте размер пикселя с помощью кнопки выборки Nyquist для автоматического расчёта.
Далее установите время пикселя. Теперь выберите режим последовательного сканирования между дорожками, чтобы минимизировать перекрёстные контакты. Нажмите Snap, чтобы получить одно изображение.
Сохраните изображение с соответствующими метаданными. Для согласованных настроек между оптическими секциями убедитесь, что все параметры изображения настроены на одной оптимальной фокальной плоскости перед определением Z-стека. Откройте вкладку Acquisition и выберите режим Z-stack.
Определите объём интереса, используя быстрый живой скан, чтобы сначала сосредоточиться на самой нижней структуре, затем нажмите Set Last или Bottom. Аккуратно настройте фокус до самой верхней интересующей структуры и нажмите Set First или Top. Программа затем отображает общую глубину.
Размер Z-стека установлен так, чтобы соответствовать критерию выборки Найквиста. Используйте кнопку «Оптимальный» для автоматического расчёта. После настройки параметров изображения для каждого канала увеличьте мощность лазера или небольшое усиление для слабых сигналов по сравнению с одним двумерным изображением.
Начните сбор, чтобы собрать весь стек изображений. Для визуализации используйте встроенный модуль обработки микроскопа. Генерируйте проекции максимальной интенсивности для просмотра всех сигналов в фокусе на одном двумерном изображении.
Затем выполните рендеринг объёмов с использованием встроенных алгоритмов программного обеспечения для генерации трёхмерного представления. Регулируйте яркость, прозрачность и освещение по мере необходимости. Затем генерируйте ортогональные сечения XZ и YZ для проверки осевой протяжности и регистрации.
Многоцветная флуоресцентная визуализация фиксированных клеток COS-7 показала, что ядра, митохондрии и микротрубочки были чётко маркированы с минимальным перекрытием, что подтверждало эффективное последовательное сканирование и оптимизированное обнаружение. Проекция максимальной интенсивности интегрирует сигналы во всех оптических секциях, подчёркивая пространственное распределение флуоресцентно маркированных структур. Трёхмерная реконструкция обеспечивает глубинный обзор архитектуры образца.
Таймлапс-визуализация живых клеток гепатита 3B с митохондриями, отмеченными EGFP, сравнивается между режимами. Конфокальные кадры между временными точками показывают чёткие структуры, но постепенную потерю сигнала. Стандартные кадры с супер-разрешением или SR показывают более высокое разрешение, но со временем увеличивается фотоотбеливание.
Быстрые изображения с суперразрешением или SR-4Y сохраняют стабильную флуоресценцию даже в более поздних временных точках. График средней интенсивности флуоресценции EGFP за 100 временных точек показывает, что режим SR-4Y поддерживал наиболее стабильный сигнал. Производительность визуализации в фиксированных ячейках COS-7 сравнивалась между режимами, и режимы с суперразрешением обеспечивали более чёткие структурные детали, чем конфокальные.
Измерение функции точечного разбора с помощью 100-нанометровых флуоресцентных шариков показало, что Airyscan SR с последующей деконволюцией соединения улучшает как боковое, так и осевое разрешение по сравнению с Airyscan SR. Этот протокол позволяет исследовать морфологию органелл, динамику цитоскелетов и колокализацию молекул как в фиксированных, так и в живых клетках с разрешением примерно 120 нанометров. Самым важным аспектом этого протокола является тщательная подготовка образцов с использованием высококачественного крышного стекла и оптимизированное окрашивание для обеспечения целостности сигнала при сверхразрешенной обработке.
Следуя этой процедуре, исследователи могут проводить количественный анализ изображений, например, измерять отношение сигнал/шум или колокализацию, используя специализированное программное обеспечение, такое как ImageJ.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол демонстрирует метод для продвинутых применений визуализации с использованием конфокального микроскопа с лазерным сканированием, интегрированного с множественным детектором массива. Он позволяет многомодальную визуализацию от конфокальной до сверхразрешающей (~120 нм), делая высокоразрешительную клеточную визуализацию более доступной.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биология
- Клеточная визуализация
- Методы микроскопии
Предпосылки
- Обычная микроскопия сталкивается с ограничениями из-за дифракции.
- Методы сверхразрешающей визуализации могут быть сложными и фототоксичными.
- Этот протокол направлен на снижение барьеров для сверхразрешающей визуализации.
- Он сосредоточен на конфокальной множественной детекции для улучшения доступности.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол для высокоразрешительной визуализации.
- Способствовать изучению клеточных и субклеточных структур.
- Повысить доступность сверхразрешающих методов.
Используемые методы
- Настройка конфокального микроскопа и среды контроля.
- Конфигурация параметров визуализации для оптимальных результатов.
- Последовательное сканирование для минимизации перекрестных сигналов между каналами.
- Получение и обработка изображений для визуализации.
Основные результаты
- Демонстрируется эффективная визуализация клеточных структур с минимальным наложением.
- Показано улучшение разрешения в режимах сверхразрешения по сравнению с конфокальным.
- Показана важность тщательной подготовки образца.
- Предоставлены методы для количественного анализа изображений.
Выводы
- Этот протокол позволяет подробное исследование морфологии и динамики органелл.
- Он поддерживает как фиксированные, так и живые клеточные приложения для визуализации.
- Исследователи могут достичь примерно 120 нм разрешения.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Super-resolution confocal microscopy with multiplex detection enables nanoscale visualization of subcellular structures while reducing phototoxicity and operational complexity. This protocol supports high-content, quantitative imaging workflows essential for early discovery, target validation, and mechanistic de-risking in biopharma R&D. The integrated platform and shared management model facilitate scalable, reproducible imaging across diverse research teams and portfolio projects.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of organelle morphology and cytoskeleton dynamics at ~120 nm resolution.
- Supports functional target validation by quantifying molecular colocalization and spatial distribution.
- Reduces mechanistic ambiguity through high signal-to-noise imaging of subcellular processes.
- Facilitates predictive confidence in early-stage biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream phenotypic screening and compound evaluation.
- Standardizes imaging parameters for reproducibility and cross-study comparability.
- Enables multiplexed, multicolor fluorescence detection for complex assay development.
- Delivers quantitative outputs suitable for automated image analysis and screening pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cellular models for translational biomarker studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling both fixed and live cell imaging.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions based on quantitative subcellular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery, screening, and translational research by providing a unified imaging workflow from confocal to super-resolution modes.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via nanoscale imaging of cellular structures.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through standardized, multiplexed imaging protocols.
- Analytics: Generates quantitative measurements such as signal-to-noise ratio and colocalization for robust data analysis.
- Translational Research: Enables biomarker alignment and disease model validation with high-resolution, multimodal imaging.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, shared resource model for sustainable imaging infrastructure across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic risk in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust quantitative imaging.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, sample preparation, and image analysis.
- Needs access to multiplexed confocal platforms and computational processing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of imaging parameters and metadata management.
- Adaptable to both fixed and live cell models with attention to phototoxicity and staining optimization.
- Dependent on high-quality cover glass and optimized sample preparation for super-resolution performance.
