Рабочий процесс криоэлектронной томографии для толстых тканей, продемонстрированный на гиппокампе мышей

Мои исследования сосредоточены на создании стандартизированного рабочего процесса крио-инопланетянина, чтобы позволить провести структурный анализ на месте толстых тканей, таких как гиппокамп мыши. Существующие методы ненадёжны для толстых тканей, поэтому этот протокол интегрирует оптимизированные шаги для стандартизированного анализа. Для начала нанесите 10-литровую каплю раствора сахарозы 10% на чистую стеклянную поверхность.

Быстро вскрыть гиппокамп у только что усыпленной мыши. С помощью острого лезвия отрежьте мелкие кусочки ткани размером 0,5–1 кубических миллиметров. Используя зубочистку или тонкую щётку, перенесите ткань на подготовленные медные опорные сетки TEM внутри высоконапорного замораживающего носителя.

Используйте 2-метилпентан, чтобы поддерживать ткань влажной и корректировать её положение на сетке, минимизируя механические нагрузки и избежать повреждения сетки. Затем накройте ткань и сетку медным фольгированным диском диаметром 3 миллиметра. Для завершения сборки положите вторую заморозку высокого давления, плоской стороной вниз, сверху, чтобы получить герметичный вафельный сэндвич.

И проверьте параметры зависания, чтобы убедиться, что в приборе нет отклонений. Убедитесь, что общее время от рассечения ткани до заморозки не превышает 90 секунд. Получите новую сетку золота на 300 мешей, которая будет служить последней приемной сеткой для процедуры подъёма.

Под стереомикроскопом при комнатной температуре аккуратно зарежете сетку в совместимое кольцо крио-FIB AutoGrid. Затем храните собранный AutoGrid непосредственно в сухой печи, поддерживаемой примерно при 40 градусах Цельсия, чтобы минимизировать накопление инея перед использованием. При непрерывном погружении сборки в жидкий азот аккуратно отделяйте витрифицированную сетку TEM от окружающих компонентов вафельной сборки.

С помощью предварительно охлаждённого тонко-наконечного пинцета аккуратно разъедините два высоконапорных замораживающих переносчика. Далее, на предварительно охлажденной рабочей станции с крионагрузкой, изолированную тканевую сетку смонтировать во второе кольцо крио-FIB AutoGrid под защитой жидкого азота. Загрузите обе AutoGrid в отведённые слоты держателя образцов криотрансферного шаттла.

Ориентируйте каждую AutoGrid так, чтобы фрезерная вырезка была обращена наружу и располагалась вертикально, чтобы обеспечить меньший угол фрезера. Полностью загруженный шаттл держите в жидком азоте или в предварительно охлажденном состоянии до передачи в FIB-SEM. Загрузите этап сэмпла в инструмент с помощью стержня для сэмпла.

После криопереноса в микроскоп перейдите к тканевой сетке с низким увеличением SEM. Затем нанесите покрытие сеткой платиной на 30 миллиамперов в течение 15 секунд для защиты проводящей. Нанесите органометаллическую платиновую крышку толщиной 0,5–1,0 микрометра с помощью системы впрыска газа примерно на 60 секунд.

Нанесите финальный платиновый слой с покрытием распыления на поверхность сетки при 30 миллиамперах в течение 15 секунд. Используя изображение электронного луча SEM, переместитесь к выбранной области интереса на сетке тканей. Чтобы ориентировать образец для фрезера с фронтальной стороны, отрегулируйте ступень примерно на 110 градусов вращения и наклон 7 градусов, чтобы представить поверхность образца под углом, подходящим для доступа ионного пучка.

Для траншейного фрезера определите прямоугольную траншею, окружающую целевой блок ткани, используя ионный пучок, управляемый при напряжении 30 киловольт. Начинайте фрезер на расстоянии от блока с относительно высоким током 15 наноампер для быстрого удаления материала. Когда стенки траншеи приближаются к блоку на расстоянии нескольких микрометров, уменьшите ток ионного пучка до 7 наноампер для более точного управления фрезером.

Оставьте одну сторону блока прикреплённой к основному материалу, чтобы создать временный удерживающий язычок. Для тканевых блоков с оценочной толщиной более 20 микрометров выполните ступень подрезки с обратной стороны для окончательного подъёма. Поверните сцену и отрегулируйте наклон, чтобы получить доступ к нижней части блока.

Фрезеруйте нижнюю часть соединения, используя сфокусированный ионный пучок под напряжением 30 киловольт и ток 3 наноампера. Фрезеруйте нижнюю часть металлического блока так, чтобы она плотно прилегала к пробному блоку. Точная фрезеровка контактной поверхности между образцом и золотым блоком делает контакт более плотным.

Чтобы прикрепить образец к игле, убедитесь, что золотой блок находится в прямом контакте с целевым образцом. Используя сфокусированный ионный пучок при напряжении 30 киловольт и 0,5 наноампера, выполните 8–12 последовательных поперечных фрезерных схем на интерфейсе для сварки золотого блока к образцу. Чтобы поднять тканевой блок, оставшуюся вкладку, соединяющую блок с объёмным образцом, с помощью сфокусированного ионного пучка.

Аккуратно управляйте иглой микроманипулятора, чтобы полностью поднять изолированный блок ткани за пределы траншеи и окружающей сетки. Уберите иглу и перенесите блок к приемной сетке. Проведите стрелку микроманипулятора к предварительно охлажденной золотой сетке на 300 сеток.

Опустите блок на выбранный квадрат сетки. Измельчите мелкие ледяные кристаллы на сетке, чтобы блок ткани и сетка прилипали плотнее. Опустите тканевой блок так, чтобы он просто соприкасался с сеткой.

Измельчите срез толщиной 3–4 микрометра от блока на сетчатую пленку с помощью ионного пучка. Далее надёжно сварите срез с помощью фрезеровки, используя узоры поперечного сечения с обеих сторон соединения, и заново нанесите проводящее и защитное покрытие на поверхность решётки, как было показано ранее. Для истончения ламели после установки наклона сцены определите окончательное положение ламелли в гладкой области блока ткани.

Проведите систематическое фрезерование с использованием токов ионного пучка и компенсаций избыточного наклона, указанных в приведённой таблице. Если от ламелли находится в пределах 1–2 микрометров, по желанию фрезеруйте траншею для снятия напряжений примерно на расстоянии 1,5 микрометра, чтобы предотвратить сгиб или скручивание ламелли. После подготовки ламели получите изображения с помощью криоэлектронной микроскопии.

Тканевые блоки, обработанные методом замораживания под высоким давлением методом, имели равномерный и электронно-прозрачный вид. Реконструированные томограммы разрешили митохондриальные структуры внутри клеточной среды. Макромолекулярные комплексы, такие как рибосомы, были явно разрешены в цитоплазме.

Цитоскелетные и мембранно-ассоциированные клеточные особенности, а также ядерные поровые комплексы также были видны на реконструированных томограммах. Синаптические структуры и особенности, включая запасы кальция и миелиновые оболочки, были явно видны на томограммах. Этот протокол позволяет исследователям изучать нативную клеточную внешнюю структуру непосредственно в сложных тканевых средах.

Самой критической задачей в этом протоколе крио-ЭТ является достижение равномерной, без артефактов витрификация образцов толстых тканей. После этой процедуры исследователи могут локализовать интересующие области с помощью корреляционной световой и электронной микроскопии или методов маркировки, затем проводить субтомограммное усреднение и анализ структуры для разрешения макромолекулярных комплексов.