Секвенирование и сборка плазмид с длинным чтением с использованием рабочих процессов на основе секвенирования нанопор

Мы исследуем репликацию, поддержку и распространение самореплицирующихся круговых ДНК-элементов, известных как плазмиды, что требует определения их последовательностей. Этот протокол решает проблемы покрытия и точности, связанные с секвенированием длинных читаний, обогащая плазмидную ДНК и оптимизируя методы сборки. Наш протокол предназначен для секвенирования плазмид в случаях, когда хромосомная последовательность либо известна, либо не имеет значения.

Для начала выполните намазывание образцов на пластинки LB с добавлением соответствующего антибиотика для селекции плазмидных маркеров устойчивости. Инкубируйте пластинки при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. На следующий день инокуляйте три-пять миллилитров среды LB с соответствующим антибиотиком с помощью одной изолированной колонии.

Инкубируйте культуру с агитацией при 37 градусах Цельсия примерно восемь часов или пока оптическая плотность при 600 наноиметрах не достигнет одного-двух. Затем инокуляйте 400 миллилитров среды LB с соответствующим антибиотиком 400 микролитрами стартовой культуры и инкубируйте, как было показано ранее. Затем перенесите культуру в центрифугальные бутылки, соответствующие объему культуры.

Центрифугируйте при 4200 G в течение 10 минут и взвесьте осадок, используя объемы реагентов, рекомендованные производителем. После лизиса клеток и нейтрализации центрифугируйте лизат при 4200 G в течение 30 минут. Перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и центрифугируйте ее снова.

Выполните эквилибрацию, промывку и элюцию ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Затем взвесьте осажденную ДНК в 100 микролитрах безнуклеазной воды для максимизации концентрации для подготовки библиотеки нанопор. Далее, для количественного определения ДНК, приготовьте анализные пробирки в соответствии с представленной таблицей.

После калибровки флюоресцентного анализатора вставьте анализные пробирки в флюоресцентный анализатор и зафиксируйте показания в соответствии с руководством по эксплуатации прибора. Запрограммируйте термоциклер на 30 градусов Цельсия в течение двух минут, затем на 80 градусов Цельсия в течение двух минут. Размешайте и перемешайте компоненты раствора по таблице.

Инкубируйте ПЦР-пробирки, подготовленные для баркодирования, используя программу термоциклера. Затем поместите пробирки на лед для охлаждения. Объедините баркодированные образцы в чистую пробирку Эппендорф объемом 1,5 миллилитра, убедитесь, что общий объем не превышает 1000 микролитров.

После встряхивания перлинов добавьте равный объем перлинов к объединенным баркодированным образцам. Перемешайте, потрепывая пробирку, затем инкубируйте в течение 10 минут. Затем промойте перлины одним миллилитром 80%-ного этанола на магните.

Удалите этанол и повторите процедуру. Снимите пробирку с магнита. Взвесьте перлины в буфере для элюции, используя соответствующий объем в зависимости от количества используемых баркодных меток, и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.

Определите концентрацию ДНК, используя один микролитр элюированного образца на флюоресцентном анализаторе, чтобы подтвердить успешную подготовку библиотеки. Для лигирования адаптеров перенесите 11 микролитров библиотеки ДНК в новую пробирку и пометьте ее. Затем смешайте представленные компоненты в свежей пробирке для разбавления размороженного быстрого адаптера.

Далее добавьте один микролитр разбавленного быстрого адаптера в 11 микролитров библиотеки ДНК и потрепывайте пробирку для смешения содержимого. Кратковременно центрифугируйте пробирку, чтобы убедиться, что весь объем соберется на дне, и инкубируйте пробирку на столе в течение пяти минут. Приготовьте смесь для инициализации потоковой ячейки в свежей пробирке с ДНК и смешайте путем инверсии и пипеточного переноса.

Снимите крышку устройства и вставьте потоковую ячейку в нее, прилагая легкое давление для обеспечения правильного размещения. После проверки отсутствия воздушных пузырьков внутри или рядом с портом инициализации, отсасывайте 20-30 микролитров жидкости, чтобы удалить пузырьки. Затем отсасывайте 800 микролитров смеси для инициализации и вводите ее в порт инициализации, избегая воздушных пузырьков, и оставьте устройство на пять минут.

Смешайте библиотеку ДНК с соответствующим объемом бисерных частиц библиотеки в новой пробирке, как представлено здесь. Загрузите 200 микролитров смеси для инициализации в порт инициализации потоковой ячейки. Отрегулируйте крышку образцового порта, чтобы открыть порт.

Вводите 75 микроли