Секвенирование и сборка плазмид с длинным чтением с использованием рабочих процессов на основе секвенирования нанопор
7 июля 2026 г.
Текущее исследование описывает рабочий процесс секвенирования нанопор плазмид, когда хромосомная последовательность уже известна или не представляет интереса. Начальный этап обогащения плазмидной ДНК обеспечивает оптимальную глубину последовательности плазмиды и максимизирует количество образцов, которые можно секвенировать в каждой ячейке потока.
Мы исследуем репликацию, поддержание и распространение самовоспроизводящихся круговых элементов ДНК, известных как плазмиды, что требует определения их последовательностей. Этот протокол решает вопросы покрытия и точности, связанные с секвенированием длинного чтения, обогащая ДНК плазмидов и оптимизируя методы сборки. Наш протокол предназначен для секвенирования плазмид в ситуациях, когда хромосомная последовательность либо известна, либо несущественна.
Для начала размените образцы на пластинах LB шнека, дополняя их соответствующим антибиотиком для отбора маркера резистентности, переносимого через плазмиду. Инкубировать пластины при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. На следующий день инокуляция от трёх до пяти миллилитров среды LB с добавлением соответствующего антибиотика с одной изолированной колонией.
Инкубировать культуру при встряхивании при 37 градусах Цельсия примерно восемь часов или до тех пор, пока оптическая плотность на 600 нанометров не достигнет одного-двух. Затем инокулируйте 400 миллилитров LB среды, дополняя соответствующий антибиотик 400 микролитрами стартерной культуры, и инкубируйте, как было показано ранее. Затем переложите культуру в бутылки с центрифугами, соответствующие объёму культуры.
Центрифугуйте при 4 200 G в течение 10 минут и повторно суспензируйте гранулу с использованием рекомендованных производителем объёмов реагентов. После лизиса и нейтрализации клетки центрифугайте лизат при 4 200 G в течение 30 минут. Перенесите супернатант в новую трубку и снова центрифугайте.
Проведите уравновесение, промывку и элюцию ДНК согласно инструкциям производителя. Затем суспензировать осаженную ДНК в 100 микролитрах воды без нуклеазы для максимизации концентрации для подготовки нанопорной библиотеки. Далее, чтобы количественно оценить ДНК, подготовьте пробирки в соответствии с представленной таблицей.
После калибровки люорометра вставьте пробирки в флюорометр и запишите показания согласно инструкции по прибору. Запрограммируйте тепловой циклер на 30 градусов Цельсия на две минуты, затем на 80 градусов Цельсия на две минуты. Разверните и смешайте компоненты размораживаемого комплекта согласно представленной таблице.
Инкубировать ПЦР-трубки, подготовленные для штрих-кодирования, с помощью программы Thermal Cycler. Затем положите трубки на лёд для охлаждения. Объедините штрихкоды образцы в чистую 1,5-миллилитровую трубку Эппендорфа, убедившись, что общий объём не превышает 1 000 микролитров.
После того как бусины будут вихрь, добавьте равный объём бусины к объединённым образцам с штрих-кодом. Смешивайте, щёлкая трубку, затем инкубацию в течение 10 минут. Затем промывайте шарики с помощью одного миллилитра 80% этанола, находясь на магните.
Удалите этанол и повторите это один раз. Снимите трубку с магнита. Заново суспензуйте шарики в буфере элюции с соответствующим объёмом в зависимости от количества используемых штрихкодов и инкубируйте 10 минут при комнатной температуре.
Измерите концентрацию ДНК, используя один микролитр выбранного образца на флюорометре, чтобы подтвердить успешную подготовку в библиотеке. Для переходной лигации перенесите 11 микролитров библиотеки ДНК в новую пробирку и промаркуйте её. Затем смешайте представленные компоненты в новой трубке, чтобы разбавить размораживаемый быстрый адаптер.
Далее добавьте один микролитр разбавлённого быстрого адаптера в 11 микролитров библиотеки ДНК и переместите пробирку, чтобы смешать содержимое. Ненадолго прокрутите трубку вниз, чтобы убедиться, что весь объём соберётся внизу, и инкубируйте трубку на столе пять минут. Подготовьте смесь для проточной клетки в свежей ДНК-пробирке и смешайте с помощью инверсии и пипетирования.
Поднимите крышку устройства и вставьте в неё проточную ячейку, прилагая мягкое давление для правильного размещения. После проверки на наличие пузырьков воздуха внутри или рядом с портом грунта, оттяните 20–30 микролитров жидкости для удаления пузырьков. Затем наберите 800 микролитров грунтовой смеси и впустите её в порт для запуска, избегая воздушных пузырьков, и оставьте устройство постоять на пять минут.
Смешайте библиотеку ДНК с соответствующим объёмом библиотечных бусинок в новой трубке, как представлено здесь. Загрузите 200 микролитров смеси для запуска в порт пускового элемента. Отрегулируйте крышку порта образца, чтобы открыть порт.
Введите 75 микролитров библиотеки ДНК с бусинами в образец по одной капле, давая каждой капле впитаться перед добавлением следующей. Затем снова нанесите крышку порта для сэмпла и закройте порт для грунтовки. После закрытия крышки устройства начинайте секвенирование.
Установите лимит времени выполнения на основе количества мультиплексируемых плазмид, по умолчанию 48 часов и максимум 72 часа. Выберите супер-точный базовый вызов и соответствующий набор для быстрого штрихкода. Затем выберите сырые данные FAST5 или POD5 и начните вызывать базу.
Для создания фильтрованного FASTQ-файла для дальнейшей сборки обрезайте длинные считывания с помощью Filtlong, чтобы удалить примерно 5-10% чтений самого низкого качества, при этом сохраняя примерно 90% от общего выхода. Подвыборка считывается с помощью Autocycler согласно рекомендуемым настройкам. Собирайте каждое подмножество чтений с помощью Raven, Flye, Kanu, Miniasm, Myloasm, NECAT, Plassembler и других выбранных ассемблеров.
Визуализируйте каждый файл графа сборки с помощью бинта. Оценивайте континги на круглость, согласованность размеров между сборщиками и наличие химерных соединений. Удалить линейные континги, не поддерживающие несколько сборщиков, и сохранить круговые контиги с согласованными оценками размера.
Удалять незначительные неподдерживаемые континги до генерации консенсуса, когда крупные плазмиды циркуляризуются. Переходите к генерации консенсуса после ручного отбора. Генерируйте консенсусную последовательность с помощью Autocycler с курируемыми сборками.
Выполните оставшиеся команды Autocycler, чтобы получить финальную последовательность консенсусных плазмид. Наконец, отполируйте финальную сборку с помощью обрезанных длинных считываний с помощью Medaka для повышения консенсусной точности. Все конъюгационные анализы производили транссоюганты, подтверждая наличие конъюгативной плазмиды у доноров.
Размеры собранных последовательностей плазмид совпадали с оценками, основанными на подвижности геля электрофореза импульсного поля. Секвенирование нанопор обеспечивало достаточный выход считывания и качество для всех анализируемых образцов. Уровень загрязнения хромосом варьировался от 72,1% до 28,0% со средним показателем 46,9%. Импульсно-полевый гель-электрофорез плазмиды штаммов UPEC_271 выявил полосу, соответствующую плазмиде примерно из 145 пар килобаз.
ДНК одного из трансконъюгантов показала последовательность, идентичную 145 килобазам. Анализ гель-электрофореза с пульсным полем в штаммовой крови 100913 выявил две плазмиды примерно с парами 70 и 110 килобаз. Секвенирование нанопор подтвердило наличие двух плазмидных сборок из 71 182 пар оснований и 111 226 пар оснований.
Самый важный фактор — представляет ли интерес хромосомная последовательность. Если да, то стандартные протоколы секвенирования целого генома лучше подходят. Расширенное покрытие нашего протокола открывает двери к изучению гетероплазмы, то есть
вариации плазмидных последовательностей внутри данной популяции.
Обзор
В данной статье представлен подробный рабочий процесс нанопорового секвенирования, направленный на максимальное увеличение выхода плазмидной ДНК и точности секвенирования. Протокол включает экстракцию плазмид, быстрое штрихкодирование, лигирование адаптеров, секвенирование и сборку последовательностей; он подходит для широкого диапазона размеров плазмид и уровней хромосомного загрязнения. Метод продемонстрирован на примере Escherichia coli как модельного организма.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Молекулярная биология
- Геномика
- Микробиология
Введение
- Секвенирование плазмид имеет важное значение для генетических исследований, экспрессии рекомбинантных генов и экспериментов по захвату плазмид.
- Традиционные методы секвенирования могут быть ограничены присутствием хромосомных загрязнений и низким выходом плазмид.
- Секвенирование Nanopore обеспечивает возможность получения длинных прочтений и сбор данных в режиме реального времени.
- Для оптимизации пропускной способности и точности секвенирования плазмид необходимы эффективные рабочие процессы.
Цель исследования
- Разработать и описать надежный рабочий процесс для секвенирования плазмид с использованием нанопор.
- Максимизировать выход плазмидной ДНК и точность секвенирования.
- Обеспечить эффективное параллельное секвенирование нескольких образцов.
Используемые методы
- Экстракция плазмидной ДНК из клинических штаммов E. coli.
- Подготовка библиотек с использованием быстрого баркодирования и лигирования адаптеров.
- Загрузка библиотек в ячейку нанопорового секвенирования.
- Определение последовательности оснований (бейсколлинг), выполняемое в режиме реального времени или апостериорно.
- Сборка последовательностей с помощью Autocycler.
- Сравнение результатов сборки с данными электрофореза и сборок, отполированных с помощью коротких прочтений.
Основные результаты
- Сборки плазмид соответствуют размерам, определенным по подвижности в геле.
- В двух третях случаев сборки совпали или были близки к сборкам, отполированным с помощью коротких чтений (в пределах 0,05% попарного сходства).
- Протокол поддерживает плазмиды размером от 4 до 174 kb.
- Допускается до 72% хромосомного загрязнения без потери точности.
- Параллельное секвенирование до 24 образцов с оптимальным покрытием.
Выводы
- Данный рабочий процесс обеспечивает точное и эффективное секвенирование плазмид с использованием нанопоровой технологии.
- Он подходит для верификации плазмид, улучшения последовательностей плазмид, полученных методом полногеномного секвенирования (WGS), и секвенирования плазмид, захваченных путем конъюгации.
- Протокол устойчив к загрязнению хромосомной ДНК и применим для плазмид различных размеров.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Нанопоровое секвенирование плазмид с длинными чтениями позволяет с высокой достоверностью проводить верификацию и сборку плазмидных конструктов, обеспечивая критически важный контроль качества и снижение технических рисков при разработке препаратов в биофармацевтике. Данный рабочий процесс решает проблему хромосомного загрязнения и вариативности выхода плазмид, предоставляя надежные и масштабируемые решения для разработки рекомбинантной ДНК и векторов для генной терапии. Возможность параллелизации и устойчивость к смешанным образцам ДНК оптимизируют процессы на этапах раннего поиска и доклинических исследований, улучшая принятие решений по портфелю разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает точную верификацию сконструированных плазмид для функциональных исследований и валидации мишеней.
- Снижает неопределенность в идентификации конструктов, способствуя минимизации рисков при изучении механизмов в фундаментальной биологии.
- Способствует быстрому отбору кандидатных конструктов для последующего скрининга или экспрессии.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные данные о последовательности для готовых к анализу плазмид, обеспечивая воспроизводимость в кампаниях по скринингу.
- Поддерживает параллельное секвенирование до 24 образцов, что увеличивает пропускную способность для библиотек конструктов.
- Обеспечивает количественную точность последовательности, позволяя проводить надежное сравнение различных модифицированных вариантов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Повышает преемственность этапов от открытия до доклинических исследований путем подтверждения целостности плазмид в системах, релевантных данной патологии.
- Обеспечивает верификацию последовательности плазмид, используемых в исследованиях по доставке генов или изучению биомаркеров.
- Поддерживает оптимизированное с учетом рисков продвижение проекта, сводя к минимуму неопределенности, связанные с последовательностью, в доклинических моделях.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Этот рабочий процесс на основе нанопор интегрирует все этапы — от первичной проверки конструкций до скрининга и доклинической валидации, поддерживая как гипотетические, так и трансляционные исследовательские циклы.
- Фундаментальная биология: Подтверждает точность последовательности плазмиды, снижая риск побочных эффектов в функциональных анализах.
- Скрининг: Обеспечивает верификацию последовательности готовых к анализу конструктов, что способствует воспроизводимости оценки соединений.
- Аналитика: Предоставляет высокоточные количественные данные о последовательности для сравнения образцов и контроля качества.
- Трансляционные исследования: Согласует верификацию последовательности плазмид с требованиями к доклиническим моделям для изучения экспрессии генов.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает масштабируемую возможность параллельного секвенирования, адаптируемую для различных программ НИОКР.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов в исследованиях с использованием генетических конструктов и снижает неопределенность механизмов действия.
- Операционная ценность: стандартизирует верификацию плазмид, допускает высокую степень хромосомного загрязнения и поддерживает высокопроизводительные рабочие процессы.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о продолжении или прекращении работ, гарантируя целостность конструктов перед дальнейшим инвестированием.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению генных активов.
Особенности реализации
- Требуются навыки экстракции плазмид, подготовки библиотек и рабочих процессов нанопорового секвенирования.
- Необходима вычислительная инфраструктура, масштабированная под нужды базового вызова (basecalling) в реальном времени или post-hoc.
- Рекомендуется использовать стандартизированные протоколы для обеспечения воспроизводимости между разными группами и сопоставимости данных.
- Метод применим к плазмидам различных размеров и различным хозяйским организмам, включая образцы с высоким содержанием хромосомной ДНК.
- Наилучшим образом подходит для приложений, где последовательность хромосомной ДНК известна или не требуется.
