Сайт-специфическая лактилирование лизина через расширение генетического кода в клетках E. coli и млекопитающих

Мы разработали тактовую тРНК-систему для преодоления ограничений по мимикрии и ферментам, что позволило точно интегрировать лизин-лактилирование для изучения биологического исследования. Этот протокол можно применить для изучения метаболизма опухоли, функций ферментов и часовых участков. Для начала ко-трансформируйте 50 микролитров химически компетентных клеток Escherichia coli DH10B с примерно 100 нанограммами каждой из желаемых плазмид. Инкубировать трансформационную смесь на льду в течение 25 минут, затем подвергнуть её тепловому шоку при 42 градусах Цельсия в течение 45 секунд.

Верните трубку в лёд на три минуты. Добавьте 350 микролитров среднего вещества Luria bertani и энергично встряхните трубку со скоростью 220 оборотов в минуту в течение часа при 37 градусах Цельсия. Теперь распределите трансформированную клеточную культуру на агарную пластину Luria bertani, дополненную ампициллином и хлорамфениколом.

Инкубировать пластину при 37 градусах Цельсия в течение 12–16 часов. Затем выберите одну колонию из тарелки, чтобы инокулировать четырёхмиллилитровую стартовую культуру и инкубировать её на ночь. На следующий день расширьте ночную культуру до 400 миллилитров среды Luria bertani, содержащего ампициллин и хлорамфеникол.

Интенсивно встряхивать культуру при 220 оборотах в минуту и 37 градусах Цельсия, пока оптическая плотность при 600 нанометрах не достигнет от 0,6 до 0,8. Далее индуцируйте культуру с помощью 0,2% L-арабинозы и одного миллимолярного лактиллизина и инкубировать при 30 градусах Цельсия и 220 оборотах в минуту в течение 16 часов. Семенные ячейки имеют 12-ядровую пластину с плотностью 10 на мощность пяти элементов на скважину, используя один миллилитр DMEM.

Инкубировать 24 часа, пока слияние клеток не достигнет от 70 до 80%, затем переходите к трансфекции. Для приготовления разбавленного раствора ДНК добавьте 0,75 микрограмма плазмиды с sfGFP репортером и pNeu-KlacRS в соотношении один к одному в 38 микролитров безсывороточного DMEM с высоким содержанием глюкозы. Аккуратно поднимайте и опускайте пипетку или ненадолго вихрь для смешивания.

Для приготовления разбавленного трансфекционного реагента добавьте 2,25 микролитра трансфекционного реагента в 38 микролитров безсывороточного DMEM с высоким содержанием глюкозы. Аккуратно протяните пипеткой вверх и вниз три-четыре раза, чтобы хорошо перемешать. Сразу же добавьте разбавленный трансфекционный реагент в разбавленный раствор ДНК сразу.

Теперь пропустите пипетку вверх и вниз три-четыре раза, чтобы смешать содержимое и инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 10–15 минут, чтобы сформировать комплексы трансфекции и ДНК. Добавьте 50 микролитров трансфекции и комплекса ДНК по капле в среду в каждой яме и аккуратно покрутите пластину для гомогенизации смеси. Через шесть часов после трансфекции замените среду свежим DMEM с одним миллимолярным лактиллизином и культурите клетки в течение 24–48 часов.

У Escherichia coli полноразмерный hENO1-89Klac образуется при добавлении одного миллимолярного лактиллизина в форму роста. Иммуноблотация подтвердила наличие полноразмерных hENO1-89Klac с использованием анти-His и анти-L-лактиллизиновых антител. Масс-спектрометрия времени полёта ионизацией электроспреем выявила доминирующий пик на уровне 48 178 дальтонов, что соответствует ожидаемой массе hENO1-89Klac без инициирующего метионина.

Тандемная масс-спектрометрия триптихового дайджеста подтвердила сайт-специфическое включение Klac в остатке 89 благодаря наличию полного серии ионов B&Y с модифицированным пептидом. В клетках HEK293T млекопитающих флуоресцентная микроскопия показала сильную экспрессию sfGFP по всей клеточке при добавлении Klac в течение 24 часов и 48 часов, при этом флуоресценция не наблюдалась без добавления Klac. Проточная цитометрия показала, что примерно 31% клеток экспрессировали sfGFP через 24 часа, увеличившись до примерно 37% после 48 часов приема Klac.

Этот протокол позволяет исследовать специфические эффекты лактилирования лизина на функцию белка и облегчает измерение биологических и функциональных результатов. После этой процедуры исследователи могут проводить механистические исследования, проводить высокопроизводительные скрининговые анализы и формировать стабильные клеточные линии для расширенного функционального анализа. Наши будущие исследования направлены на повышение эффективности, обеспечение стабильной интеграции и развитие биосинтеза часов.