Модель крыс с канюлированием шейных лимфатических протоков для оценки лимфатического транспорта из головы и мозга

Наш проект исследует, как лимфатика мозга связана с заболеваниями ЦНС, такими как болезнь Альцгеймера, инсульт и нейровоспаление, выявляя вещества, которые вытекают из мозга. Существующие методы не имели протокола и надёжного подхода для теоретического отбора и количественной оценки лимфатического оттока, полученного из ЦНС, что позволяет этот протокол. Для начала предварительно заполните примерно 0,7 миллилитра разбавлённого антикоагулянта в стерильный инсулиновый шприц объёмом один миллилитр с иглой 30-калиберной для покрытия внутренней поверхности полиэтиленовой канюли.

Храните заранее загруженный шприц в стерильных условиях до использования. Для подготовки канюль используйте трубки с внешним диаметром 0,5 мм и внутренним диаметром 0,3 мм для обеих конечных секций, а также с внешним диаметром 0,6 миллиметра и внутренним диаметром 0,5 мм для средней секции. С помощью ножниц разрежьте сегменты канюли на длину в два сантиметра для проксимальной части, соединяющей с иглой шприца, 40 сантиметров для средней части и восемь сантиметров для дистальной части, предназначенной для канюляции.

Соберите канюлю в конфигурации с головы до хвоста. Затем отрежьте и скосите дистальный конец канюли под углом примерно 45 градусов, чтобы обеспечить плавное вцепление в шейный лимфатический проток. Проверьте проездность каждой канюлы, подключив заранее загруженный шприц к проксимальному концу собранной канюлы.

Аккуратно выпустите небольшой объём раствора, чтобы промыть канюлю. Убедитесь, что раствор плавно выходит с дистального конца без признаков протечки. Поместите анестезированную крысу на спине на подогреваемую хирургическую подложку с температурой 37 градусов Цельсия.

При необходимости наклоните голову и вытяните шею с помощью небольшой поддерживающей подушки, чтобы увеличить видимость шейного отдела. Аккуратно фиксируйте передние конечности резинками или хирургическими лентами, чтобы минимизировать движение. Промывайте шерсть шейной области стерильным физиологическим раствором для облегчения бритья.

Затем тщательно сбрийте всё место операции, чтобы полностью удалить шерсть перед разрезом. Отметьте место операции, проведя пунктирную линию шириной 2,5 сантиметра, чтобы подтвердить длину начального разреза. Разместите верхний конец разреза примерно на 1–1,5 сантиметра ниже нижней губы.

После подтверждения глубины анестезии с помощью рефлекса сжатия пальцев аккуратно разрезайте поверхностный слой шейной мышцы вдоль отмеченной линии. Затем аккуратно разделите оставшиеся мышечные слои, главным образом поверхностную шейную фасцию, чтобы открыть шейную артерию. Втяните грудинномастовидную мышцу и поднижнечелюстную железу, наклоните их от хирургического поля для облегчения идентификации шейного лимфатического протока.

Используйте расширитель тканей для поддержания операционного окна. Ватной палочкой временно отдерживайте мышечную ткань, находя лимфатический узел и связанные с ним лимфатические протоки. Определите непрозрачный бесцветный шейный лимфатический проток, идущий параллельно сонной артерии.

С помощью тупых щипцов аккуратно проведите через отделённые соединительные ткани и удержите щипцы на месте. Тщательно изолируйте шейный лимфатический проток от окружающих соединительных и жировых тканей с помощью тупой диссекции. Затем сделайте небольшой разрез в верхней половине открытого сосуда.

Небольшой вторичный кожный прокол примерно в 1,5 сантиметрах от хирургического окна может служить дополнительной точкой фиксации канюлы. Вставьте канюлю через второе отверстие, захватите её дистальный конец щипцами и убедитесь, что скошенная сторона направлена вверх. Затем аккуратно введите дистальный конец примерно на два миллиметра в лимфатический проток через разрез, направляя его к головке.

Следите за проксимальной частью канюли в течение одной-двух минут. Подтвердите успешную канюляцию, наблюдая медленный и стабильный отток лимфатической жидкости. Закрепите канюлю, нанеся небольшую каплю цианоакрилатного клея с пипеткой в месте разреза и вторичном фиксирующем отверстии.

Наблюдайте за лимфотоком в течение нескольких минут, чтобы подтвердить стабильный отток. Затем аккуратно удалите расширитель ткани и переместите поднижнюю железу на исходное место. Прикрепите заранее маркированную микроцентрифугальную трубку с антикоагулянтом к дистальному концу канюлы.

Затем переместите все мышечные слои на исходные места и закройте разрез кожи швами и/или клеем для тканей. Непрерывно собирайте лимфу в микроцентрифугальные трубки с антикоагулянтами, заменяя трубки с заранее определёнными интервалами, обычно раз в час. Убедитесь, что крыса оставалась под наркозом на протяжении всего периода сбора.

Собранные образцы храните вместе со льдом в холодильнике. Почасовая скорость лимфического потока, измеренная в течение шестичасового периода сбора у успешно канюлированных крыс, варьировалась от 0,09 до 0,13 миллилитра в час. У здоровых крыс кумулятивный лимфатический транспорт внутристриатически введённого, тритий-маркированного альбумина оставался незначительным в первые два часа и значительно увеличился впоследствии.

Сравнение концентраций альбумина, помеченного тритием, между лимфой и плазмой показало разные концентрационные профили со временем у здоровых крыс. Нейровоспаление, вызванное межбрюшинным введением липополисахарида Escherichia coli, было связано с небольшим снижением общей скорости лимфопотока за восемь часов и почти вдвоеным уменьшением доли общей дозы, транспортируемой в лимфу. Соотношение концентрации лимфы к плазме не показало значимой разницы между здоровыми и нейровоспаленными крысами, что свидетельствует о схожих профилях клиренса шейного лимфа.

Этот протокол позволил проводить прямую биологическую пробу лимфы из мозга, соединяя косвенную внешнюю визуализацию или метод смолы с измеряемым оттоком центральной нервной системы. Протокол позволяет изучать централизованное очищение препарата через лимфатические пути, что позволяет измерять дренажные маршруты и скорость очистки. Будущие исследования смогут изучить, как состояния заболеваний ЦНС вызывают сигнал о лимфатическом клиренсе, и использовать эти знания для оптимизации препаратов, восстанавливающих функцию лимфатического мозга с целью лечения.