Картирование иммунитета младенцев с минимальными затратами: интегративное одноклеточное и мультиомическое профилирование

Наши исследования определяют, как иммунитет в раннем возрасте адаптируется после рождения, используя продольный высокомерный мультиомический профилирование на основе небольших объёмов крови. Этот протокол может применяться в неонатальных и педиатрических исследованиях для продольного иммунного профилирования по ограниченному количеству биообразцов в области здоровья, инфекций и воспаления. Для начала быстро разморозите флакон с лизированными младенцами, эритроцитами в водяной ванне при температуре 37 градусов Цельсия.

Переместить размораживаемые клетки в 15-миллилитровую коническую трубку с 10 миллилитрами тёплой полной среды RPMI при 37 градусах Цельсия. Центрифугуйте трубку при 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте супернатант. Заново суспензировать клеточную гранулу в трёх миллилитрах полной среды RPMI и посчитать общее количество клеток.

Разбавляйте образец, если концентрация слишком высока для подсчёта. После подсчета клеток повторяют этап центрифугирования и снова суспендируют клетки в полной среде RPMI, чтобы получить концентрацию один миллион клеток на миллилитр. Перенесите 100 микролитров, содержащих 0,1 миллиона клеток, в каждую яме пластины с 96 лунками V-образного дна.

Центрифугуйте пластину при 764 г в течение двух минут при четырёх градусах Цельсия. Отбросьте супернатант. Далее добавьте 100 микролитров живого мёртвого красителя, разбавленных от одного до 2 000 в PBS с FC-блоком и моноцитарным блоком, разбавленных от 1 до 100 во все образцы, кроме неокрашенного контроля.

Инкубировать образцы в течение 15 минут при 4 градусах Цельсия. Чтобы промыть клетки, добавьте 100 микролитров PBS. Центрифугуйте пластину при 764 г в течение двух минут при четырёх градусах Цельсия и аккуратно сбросьте супернатант.

Добавьте 100 микролитров коктейля поверхностных антител, разбавленных от одного до 200 в флуоресцентно-активированном сортировке клеток, или буфере FACS, во все образцы, кроме неокрашенного контрольного. Инкубировать 30 минут при четырёх градусах Цельсия. Затем промыйте клетки 100 микролитрами FACS-буфера, центрифугите и сбросьте супернатант.

Фиксируйте клетки, добавив 100 микролитров 4% параформальдегида в каждый образец. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, затем снова промыть клетки и снова взвесить в 200 микролитрах буфера FACS. Подготовьте компенсационные бусины UltraComp в виде одноцветных контролей.

Окрашивайте одноцветные контрольные бусины по той же процедуре, что и образцы, включая фиксацию, если образцы были фиксированы. Также подготовьте флуоресценцию без одного или FMO-регуляторов аналогичным образом. Пропустите образцы, одноцветные контроли, неокрашенные и люминесцентные контроли на обычном или спектральном потоковом цитометре.

Откройте FlowJo и выберите интересующий образец для анализа. Устанавливайте элементы с использованием соответствующих контролей изотипа и FMO. Гейт-лейкоциты используют FSC вместо SSC для исключения мусора и отбирайте клетки по размеру и детализированности.

Исключайте дублеты, использующие FSCA и FSCH. Используйте живые клетки с помощью красителя жизнеспособности, чтобы исключить мёртвые клетки. Из живых одиночных клеток делятся на CD33-отрицательные лимфоциты и CD-33-положительные миелоидные клетки.

Внутри CD33-положительных клеток идентифицировать CD14-положительные моноциты. Затем внутри CD33-положительных клеток идентифицировать CD14-отрицательные, CD11C-положительные дендритные клетки. Теперь среди CD33-отрицательных лимфоцитов походка есть CD3-положительные Т-клетки и CD3-отрицательные CD56-положительные натуральные киллеры.

Внутри CD3-положительных Т-клеток идентифицировать CD8-положительные и CD4-положительные подмножества, а также CD3-отрицательные, CD56-отрицательные, CD19-положительные B-клетки. Для начала разморозьте один флакон с криоконсервированными эритроцитами в водяной ванне при температуре 37 градусов Цельсия. Перенесите подвеску в 15-миллилитровую коническую трубку с 10 миллилитрами Т-клеточной среды и центрифугу при 430 г на пять минут при 4 градусах Цельсия.

Отбросьте супернатант. После повторной суспензии клеточной гранулы с помощью одного миллилитра PBS добавьте ещё девять миллилитров PBS в образец. Центрифугуйте трубку при 430 г в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия и сбросьте супернатант.

Просчитайте клетки и оцените жизнеспособность с помощью исключения трипана синего цвета. Если жизнеспособность менее 70%, используйте набор для удаления мёртвых клеток следующим образом. Сначала подготовьте 1x-связывающий буфер, разбавляя 20-кратный буферный раствор стерильной двойной дистиллированной водой.

Повторная суспензия клеточной гранулы в 100 микролитрах микрошариков для удаления мёртвых клеток на каждые 10 до мощности семи клеток. Хорошо перемешайте и инкубуйте 15 минут при комнатной температуре. Поместите магнитную сепарационную колонку в соответствующую магнитную подставку вместе с трубкой для сбора трубки.

Затем уравновесьте колонку, промывая 500 микролитров 1x-связывающего буфера. Увеличите объём суспензии ячейки до 500 микролитров с 1x буфером связывания. После замены сборной трубки примените суспензию элемента к колонке и соберите проток в новую микроцентрифугу объёмом 1,7 миллилитра.

Далее промыйте колонку дважды 500 микролитрами буфера связывания и соберите проток в той же микроцентрифугной трубке. Центрифугуйте элюат при 300 г в течение 10 минут и выбросьте супернатант. Подсчитайте клетки и снова оцените жизнеспособность с помощью исключения трипана синего.

Аликвот 20 000 жизнеспособных клеток в новую микроцентрифугную трубку объёмом 1,7 миллилитра. Затем центрифугуйте клетки при 300 г на 10 минут и удалите супернатант. Снова суспендуйте клетки с помощью 40 микролитров PBS с 0,04% BSA.

Наконец, поместите трубку с клетками на лёд и немедленно отправьте её в геномный центр для генерации и секвенирования библиотеки. Сбор результатов секвенирования в формате выходов Cell Ranger. Были обработаны образцы засохших пятен крови у недоношенных младенцев и контрольных групп.

И нормализованная экспрессия белков у 92 иммунно-родственных белков была количественно измерена. Экспрессия гена активации лимфоцитов номер три и трансмембранного адаптера с регулированием сигнального порога 1 была значительно выше в периферической крови у недоношенно рожденных детей в возрасте двух месяцев по сравнению с пуповинной кровью срока. Комплексная стратегия гейтинга была использована для идентификации популяций лейкоцитов на основе образцов лейкоцитов, лизированных с эритроцитами.

Внутри популяции Т-клеток были выделены CD4-положительные и CD8-положительные подгруппы. После фильтрации было собрано и профилировано более 120 000 ячеек в наборе данных секвенирования рибонуклеиновой кислоты. Анализ уменьшения размерности и кластеризации выявили 14 различных кластеров клеток.

Клеточные кластеры были аннотированы на основе дифференциально экспрессированных генов и известных клеточных маркеров. 12 из 14 кластеров соответствовали линиям иммунных клеток, включая Т-клетки, природные киллеры, В-клетки, миелоидные клетки и нейтрофилы. Столбчатая диаграмма показала относительную долю ячеек в кластере за одну неделю, один и два месяца возраста.

Это исследование позволяет измерять клеточные, транскриптомные, протеомные и функциональные иммунные сигнатуры по продольной основе образцов крови ограниченного объёма. Будущие исследования могут использовать эти методы для определения здоровых иммунных траекторий и выявления нарушений иммунных ответов в раннем возрасте, связанных с заболеваниями.