Метод стабилизации мембранных белков в нанодисках

Этот протокол подчеркивает воспроизводимый рабочий процесс восстановления нанодисков с использованием сгенерированной методологической структуры. Детергентные средства дестабилизируют мембранные белки. Нанодиски с МСП и липидами воспринимают нативную структуру для крио-ЭМ и лизиса.

Начните с добавления липидных компонентов, приготовленных в хлороформе, в стеклянную пробирку, чтобы получить липидную смесь объемом 100 микролитров, и тщательно перемешайте. Испарить хлороформ под мягким потоком азота, пока вся жидкость не будет удалена. Добавьте примерно два миллилитра n-пентана по капле в стеклянную пробирку и испарите растворитель с помощью азота, чтобы получить сухую, прозрачную липидную пленку.

После ослабления крышки трубки поместите трубку в вакуумный десикатор. Выпустите осушитель и поддерживайте его в вакууме, чтобы удалить остатки растворителей. Затем удалять липидную пленку из вакуумного осушителя и добавлять 250 микролитров безмоющего буфера с низким содержанием соли для увлажнения липидной пленки, получая итоговую концентрацию липидов 10 миллиграммов на миллилитр.

После повторного взвешивания липида равномерно разделите его на четыре стеклянные трубки. Соникуйте подвески, пока они не станут прозрачными и прозрачными, что указывает на успешное формирование липосом. Затем немедленно промывайте промежуточный просек каждой трубки азотным газом и храните при минус 80 градусах Цельсия до использования.

После трансформации клеток E.coli BL21 с плазмидой MSP1D1, несущей метку 7-гистидина и последующего расширения культуры. Индуцировать экспрессию MSP, добавляя IPTG к конечной концентрации 0,5 до одного миллимоляра. Затем продолжайте культивировать клетки при 16 градусах Цельсия в течение 16–20 часов с встряхиванием.

Центрифугуйте бактериальную культуру при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Отбросьте супернатант и оставьте клеточную гранулу. Затем суспензировать гранулу, полученную из одного литра культуры, в 100–150 миллилитрах лизисного буфера.

Тщательно гомогенизируйте до достижения равномерного подвешения без видимых комков. Далее используйте охлаждаемый ультразвуковой клеточный дезруптор для разрушения бактерий на мощности 35% с циклами трёхсекундных импульсов, после чего следуют шестисекундные паузы. Продолжайте соник, пока лизат не станет прозрачным и светло-коричневым.

Центрифугуйте лизат при 30 000 г в течение 45 минут при 4 градусах Цельсия и соберите супернатант для последующих этапов. После инкубации супернатанта с уравновешенной никел-НТА-смолой и промывания для удаления примесей, элюируйте целевой белок с помощью элюсионного буфера и собирайте элуатные фракции. Продолжайте собирать фракции, пока поглощение элуата на 280 нанометров не опустится ниже 0,01.

Затем переложите скопившийся элюат в диализную трубку и диализируйте его против диализа при температуре 4 градусов Цельсия с аккуратным перемешиванием в течение ночи. После диализа концентрируйте раствор с помощью ультрафильтрационного устройства для получения конечной концентрации MSP от двух до пяти миллиграммов на миллилитр. Весить примерно 250 миллиграммов биошариков в 50-миллилитровую центрифугную трубку.

Добавьте в пробирку 25–30 миллилитров метанола. Тщательно поверните или закрутите смесь в темноте. После инкубации трубки при 4 градусах Цельсия в течение 20 минут аккуратно сбросьте супернатант и повторите промывку метанолом ещё два раза.

Проведите аналогичные промывания с двойной дистиллированной водой три раза, затем добавьте 25–30 миллилитров буфера без моющих средств и с низким содержанием соли в шарики. Встряхните или покрутите трубку на вращающем столе для смешивания и инкубации, как показано ранее. Отбросьте супернатант и повторите этап уравновешения буфера с низким содержанием соли три раза, чтобы полностью кондиционировать шарики.

Разделите активированные биошарики поровну на три микроцентрифугные трубки объемом 1,5 миллилитра для дальнейшего использования. Возьмите один аликвот заранее подготовленного липидного запаса и разморозите его. Немедленно центрифугуйте трубку при 7 000 г на пять секунд при 4 градусах Цельсия, чтобы собрать содержимое на дне.

Ультразвуковой анализ липидного запаса в водяной бане с амплитудой 60% и отслеживайте прозрачность и температуру каждые пять-десять минут, чтобы предотвратить перегрев. Продолжайте соникацию, пока липидный запас не станет прозрачным и прозрачным. Вычислите молярное количество белка целевой мембраны с помощью представленного уравнения.

Затем рассчитать необходимые объёмы растворов MSP и липидных запасов на основе молярного стехиометрического отношения целевого белка к MSP к липиду от одного к пяти к 250. Комбинируйте соответствующие объёмы липидов и MSP, чтобы приготовить мастер-смесь объемом 300 микролитров, и инкубировать на льду в течение 10 минут. Затем медленно добавьте 50 микролитров смеси в концентрированный белковый раствор, аккуратно пипетируя для обеспечения однородности.

Затем положите смесь на лёд на час и аккуратно переворачивайте трубку каждые 15 минут, чтобы тщательно перемешивать. Теперь возьмите один аликвот предварительно активированных биошариков и аспирируйте остаточный буфер с низким содержанием соли. Добавьте белковый раствор в бусины и инкубируете с вращением в темноте в течение часа при 4 градусах Цельсия.

Центрифугуйте смесь при 7 000 г в течение пяти секунд при четырёх градусах Цельсия. Аккуратно перенесите супернатан во второй аликвот био-бусин, из которых был аспирирован низкосолёный буфер. После хорошего смешивания содержимого мягкой инверсией инкубируют в темноте четыре-восемь часов или ночью.

После кратковременного центрифугирования белкового раствора переведите супернатант в третий аликвот предактивированных биошариков. Инкубировать с вращением при 4 градусах Цельсия в темноте в течение одного часа. После короткой центрифугирования перенесите супернатант в чистую трубку микроцентрифуга.

Центрифугуйте при температуре 17 000 г при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут для удаления заполнителей. После очистки нанодисковых комплексов TASK2 с помощью хроматографии с исключением размера, пиковые фракции из элюции объедините и концентрируйте их в итоговую нанодисковую концентрацию TASK2 — 1,2–1,5 миллиграмма на миллилитр. Для проверки сборки нанодиска проанализируйте образцы с помощью 12%SDS-PAGE и подтвердите наличие MSP и белка мембраны.

Профиль хроматографии с исключением размера показал два основных пика, соответствующие собранному нанодисковому комплексу — 15,1 миллилитра и свободному MSP — 18,0 миллилитров. Количественная оценка пиковых площадей показала, что собранный пик нанодиска имел площадь 147,2. В отличие от этого, пик свободного MSP имел площадь 31,5, что соответствует эффективности сборки 82,4%. Комиграция целевой белки и MSP в SDS-PAGE подтвердили их включение в один нанодисковый комплекс.

Этот протокол помогает исследователям изучать структуру белка мембраны с использованием конституции нанодискового массива. Самая сложность — оптимизировать соотношение мембранного белка, MSP, и липид. Функциональные анализы, поверхностный плазмонный резонанс и масс-спектрометрия также могут выполняться с помощью этой процедуры.