Модель травмы гипоксии и реоксигенации в самособирающихся кардиоидах человека

Наше исследование сосредоточено на поиске новых способов помочь сердцу восстановиться после травмы. Для этого мы генерируем самособирающиеся сердечные органоиды и проводим исследования гипоксии и реоксигенации. Этот протокол может применяться для изучения реакции на травмы, терапевтических вмешательств для стимулирования регенерации, а также для моделирования заболевания, специфичного для пациента.

Для начала аспирируйте спецификационную среду сердечной мезодермы D1 и добавьте достаточно раствора для отслоения клеток, чтобы полностью покрыть индуцированные человеком плюрипотентные сердечные мезодермы, полученные из стволовых клеток. Затем поставьте тарелку в инкубатор при 37 градусах Цельсия на пять минут. С помощью пипетки добавьте равный объём сердечной мезодермической среды D2 в каждую яму, аккуратно протяните пипеткой вверх и вниз, чтобы освободить прилипшие клетки, затем перенесите суспензию клетки в коническую трубку объёмом 15 миллилитров.

С помощью центрифуги пеллетируйте клетки при 300G в течение трёх минут при комнатной температуре. Суспензировать гранулу в одном миллилитре среды D2 сердечной мезодермы, содержащей пять микромоляров IWP-2 и 50 микрограммов на миллилитр аскорбиновой кислоты в RB минус. Смешайте 10 микролитров трипан-синего с 10 микролитрами клеточной суспензии в микротрубке.

Посчитайте клетки с помощью предпочтительного метода подсчёта, затем разведите их до концентрации 100 000 клеток на миллилитр в среде специфического сердечного мезодерма D2 с добавлением двух микромоляров тиазовина. Перенесите суспензию ячейки в реагентный резервуар соответствующего размера. Затем, используя многоканальную пипетку, впустите по 100 микролитров в каждую яме ультранизкой установки с 96 ячеек, чтобы достичь конечной концентрации 10 000 ячеек на колодцу.

Вращайте пластину при 500G в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы вызвать формирование органоидов сердца человека в суспензионной культуре. Наблюдайте образование крупной, хорошо очерченной клеточной гранулы в каждой колодце. Если грануля не ограничена, повторяйте центрифугирование.

Через 24 часа приготовьте 10 миллилитров среды D3, содержащего пять микромоляров IWP-2 и 50 микрограмм на миллилитр аскорбиновой кислоты в RB минус на пластину. С помощью многоканальной пипетки добавьте 100 микролитров среды D3 в каждую яму, не удаляя существующие слои. На следующий день удалите 100 микролитров среды D3 из каждой скважины.

Чтобы минимизировать риск аспирации, наклоните пластину под углом 45 градусов и держите многоканальную пипетку под углом 90 градусов к боковой стенке пластины. Плотно прикрепляйте пипетку к стенке колодца и медленно вдыхайте воздух. После удаления среды замените его на 100 микролитров среды D4 с пятью микромолярами IWP-2 в RB минус.

С помощью пипетки объемом 1 000 микролитров с отрезанным кончиком переместите сердечные органоиды человека в микроцентрифугную трубку объемом 1,7 миллитра. Дайте органоидам опуститься на дно трубки и аккуратно удалите лишнюю среду. Один раз добавьте физраствор с фосфатным буфером, чтобы промыть органоиды.

Подождите несколько секунд, пока они опустятся, и аккуратно удалите лишний PBS. Затем добавьте 4% параформальдегид для фиксации органоидов и поместите трубку при комнатной температуре на 30 минут для фиксации. Затем перенесите нужное количество фиксированных органоидов в микроцентрифугную трубку объёмом 1,7 миллилитра.

Удалите фиксирующий раствор и промите органоиды PBS с содержанием 0,1% Tween 20. Приготовьте раствор первичного антитела, разбавляя его до нужной концентрации в растворе для окрашивания. С помощью пипетки добавьте от 50 до 100 микролитров раствора первичного антитела в каждую пробирку микроцентрифуги, обеспечивая полное покрытие органоидов.

После инкубации и последующих промыв инкубировать образец с разбавлением вторичного антитела, разбавленных в растворе для окрашивания, в течение 24 часов при температуре 4 градусов Цельсия на встряхивающей платформе. После инкубации выполните промывки, как было описано ранее. Далее, используя наконечник пипетки, перенесите органоиды на стеклянный слайд с положительным заряжением.

Аккуратно удалите лишний PBS с помощью Tween 20 и добавьте несколько капель монтажного материала, чтобы покрыть органоиды. Аккуратно накройте накладку на органоиды, чтобы разгладить их. Затем проведите флуоресцентную микроскопию.

После инкубации фиксированных органоидов за ночь в 30% сахарозы при 4 градусах Цельсия переложите их в пластиковую форму и добавьте небольшую каплю оптимальной температуры резки в форму, чтобы покрыть органоиды. С помощью тонкого пинцета или наконечника пипетки аккуратно переместите органоиды в смеси, чтобы они не скомпались и не касались краёв формы. Органоиды располагаются как можно ближе к нижней части формы, чтобы максимально увеличить количество присутствующих в одной криосекции.

Поместите форму в охладитель из пенопласта, содержащий слой сухого льда, чтобы заморозить начальный слой оптимальной температуры резки. Подождите несколько минут, пока смесь не затвердеет, а затем переместите форму на стол. Добавляйте дополнительную оптимальную температуру резки, пока форма не заполнится.

Дайте первому слою полностью растаять, прежде чем вернуть форму в сухой лёд для полного замерзания. После заморозки храните формы при минус 80 градусах Цельсия или переходите к криосекции для получения шестимикрометровых срезов. С помощью пипетки переместите пять миллилитров гипоксийной среды на 96-лужную кардиорганоидную пластину человека в колбу для клеточной культуры.

Поместите колбу в камеру гипоксии и промите камеру аноксическим газом, состоящим из 5% углекислого газа и 95% азота, в течение трёх минут. Поместите камеру в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия минимум на час перед началом гипоксии. С помощью многоканальной пипетки извлекаем примерно 150 микролитров среды из всех колодц сердечно-органоидной пластины человека.

Затем, используя пипетку объёмом 200 микролитров, аккуратно удаляйте оставшуюся среду из каждой отдельной ямы, не нарушая органоиды. Добавьте в каждую скважину 50 микролитров среды для гипоксии. Вставьте органоидную пластину сердца человека в камеру гипоксии.

И промыть камеру аноксическим газом, состоящим из 5% углекислого газа и 95% азота, в течение трёх минут. Поместите камеру гипоксии в инкубатор при 37 градусах Цельсия на шесть часов. Чтобы начать реоксигенацию, извлеките кардиологоиды человека из камеры гипоксии.

С помощью многоканальной пипетки добавьте 150 микролитров предварительно нагретого RB+медиа в каждую скважину. Наконец, поместите пластину в инкубатор при 37 градусах Цельсия и дайте минимум три часа реоксигенации перед проведением анализов по следующему потоку. После шести часов гипоксии и 24 часов реперфузии активность внеклеточной лактатдегидрогеназы значительно увеличилась у повреждённых сердечно-сосудистых органоидов человека по сравнению с неповреждёнными контролями.

Сердечные органоиды, лечащиеся гипоксией, демонстрировали кардиомиоцитные ядра с положительным TUNEL, а процент ядер кардиомиоцитов, положительных к TUNEL, был значительно выше у повреждённых органоидов по сравнению с неповреждёнными контрольными группами. Наблюдалось временно-зависимое увеличение образования рубцов с увеличением длительности гипоксии перед реоксигенацией. Через 24 часа после реперфузии 69% неповреждённых сердечных органоидов человека бились, тогда как ни один из повреждённых органоидов не бился.

Неповреждённые кардиорганоиды человека демонстрировали синхронизированные кальциевые транзиенты в пяти интересующихся областях, при этом пики происходили одновременно и с похожими формами волн. Повреждённые кардиорганоиды человека не проявляли скоординированных сокращений, а вместо этого демонстрировали нерегулярные спонтанные кальциевые транзиенты в интересующих областях. Этот протокол позволяет исследователям имитировать инфаркт миокарда у сердечно-сосудистых органоидов человека, полученных с iPSC.

Самая большая техническая сложность при обеспечении воспроизводимых повреждений — полное удаление существующих сред. Наши будущие исследования направлены на выявление факторов, способствующих регенерации тканей в кардиорганоидных моделях человека.