Отбор образцов окружающей среды ДНК с судов для наблюдения за китами для мониторинга китообразных

Этот протокол обеспечивает стандартизированный подход к отбору образцов eDNA китов во время круизов по наблюдению за китами. Существует множество различных методов отбора проб eDNA. Это затрудняет сравнительный анализ данных.

Наш протокол оптимизирован с учётом условий окружающей среды и обеспечивает защиту от загрязнения. При поддержке радиолаборатории eDNA этот протокол может выполняться неспециалистами и гражданскими учёными во время наблюдения за китами и по всему миру. Для начала подготовьте материалы для полевой документации, включая полевые технические листы и ламинированный пошаговый протокол для отбора образцов ДНК из окружающей среды китообразных.

Поставьте в коробку водонепроницаемый маркер, два eDNA-фильтра на каждый флукпринт, достаточное количество перчаток и отдельный контейнер для отходов. Подготовьте одно или несколько жёстких ведер, подходящих для типа сосуда и бортовой конфигурации, вторичный контейнер для экологической ДНК и переносной перистальтический или вакуумный водяной насос. Надевайте перчатки во время обращения с оборудованием и меняйте перчатки между заданиями.

Для стерилизации оборудования примените разбавленный раствор бытового отбеливателя, равномерно расбрызгая все поверхности ведер, крышек, контейнеров и насосных трубок. Тщательно прополосните водопроводной водой три раза. Возьмите все материалы на борт до прибытия пассажиров и храните их в специально отведённом чистом месте.

Координировать время отбора проб и позиционирование судна с экипажем судна. Наблюдайте за узорами всплывания на воде, чтобы предвидеть погружения китов. Соберите 20 литров морской воды с флюкпринта как можно скорее, обеспечив задержку не более 10 минут после погружения кита.

Получите образцы из различных регионов с использованием индивидуальных логистических условий, соответствующих каждому месту и типу судна. При необходимости транспортируйте собранную воду на специально оборудованную фильтрационную станцию на борту, чтобы избежать пролива. Зафиксировать идентификацию вида, координаты географической системы позиционирования, время и идентификацию образцов реплицирования в техническом листе.

Поменяйте перчатки перед фильтрацией. Откройте фильтрующий мешок и держите фильтр только у выхода. Вставьте впуск в трубку, затем подключите трубку насоса к выходу.

Погрузите трубку в образец воды, не погружая корпус фильтра, и установите насос на быстрый и стабильный расход. Фильтруйте 10 литров непрерывно, контролируя стабильность потока. Затем переверните фильтр и запустите насос на 30–60 секунд, чтобы удалить остатки воды.

Настройте систему фильтрующего насоса в соответствии с условиями поля. Выключите насос и отсоедините трубку. Положите фильтр в оригинальный пакет и сразу же маркируете.

Смените перчатки и подготовьтесь к фильтрации для второй копии. Храните самосохраняющиеся ДНК-фильтры в безопасном сухом контейнере в затенённой комнате с температурой окружающей среды. Если температура окружающей среды превышает 20 градусов Цельсия, храните фильтры в холодильнике, и отправляйте в течение трёх месяцев.

Проводите все лабораторные процедуры в специализированных ультрафиолетовых стерильных помещениях с достаточной вентиляцией. После надевания перчаток без ДНК и защитной одежды тщательно очистите верстаки. Используя щипцы без ДНК, сверните фильтрующую мембрану в треугольники и перенесите её в реакционную трубку объёмом 2 миллилитра с наконечником, ориентированным вниз.

Добавьте в каждую реакционную трубку 400 микролитров буфера лизиса, состоящего из 380 микролитров буфера TES и 20 микролитров протеиназы K. Вихрь кратковременно инкубируется при 56 градусах Цельсия не менее трёх часов с возбуждением. Поместите фильтр в пластиковый вход с перфорированным дном и центрифугуйте при температуре 18, 626G на 10 минут при комнатной температуре, чтобы отделить буфер от фильтра.

Реагенты для экстракции пипетт в промывочные и элюсионные пластины. Используйте несколько связующих пластин, если общий объём лизата превышает 300 микролитров. Вихрь магнитных частиц и добавьте 30 микролитров на каждую скважину в первой связывающей пластине.

Запустите предварительную программу поглощения ДНК для двух связывающих пластин и последующую программу экстракции ДНК на роботе. Чтобы провести все реакции QPCR в тройном экземпляре, подготовьте необходимую мастер-смесь в отдельном рабочем пространстве и распределите её по скважинам. Добавьте три микролитра либо стандарта целевой ДНК, либо экстракта eDNA в каждую скважину.

После запечатывания подготовленной ПЦР-пластины центрифугуйте её при 3 500 G в течение 10 секунд и переведите пластину в термоцикл с количественным ПЦР в реальном времени. Наконец, проведите анализ в оптимальных условиях для велосипеда. В заливе Скьяльфанди, Исландия, и на Азорских островах, было собрано 247 образцов экологической ДНК или eDNA, при этом использовалось до 10 литров морской воды с двумя самосохраняющимися eDNA-фильтрами на каждый флюкпринт.

Из 44 eDNA-фильтров, проанализированных на eDNA горбатого кита, 20 дали сигналы амплификации, тогда как 24 не показали амплификации. Экстракционные заготовки, полевые контроли и количественные ПЦР-тесты не показали обнаруживаемого усиления, что указывает на отсутствие загрязнения. Среди положительных реакций девять eDNA-фильтров дали как минимум одно пороговое значение цикла ниже предела обнаружения и были классифицированы как надёжные обнаружения.

Оставшиеся 11 фильтров EDNA выдали значения порога цикла выше предела обнаружения, указывая на правдоподобные обнаружения. Среднее значение порога цикла было немного ниже в фильтрах eDNA Азорских островов — около 34,7, по сравнению с фильтрами Iceland с примерно 36,9. Разница в пороговых значениях цикла между фильтрами eDNA на Азорских островах и Исландии не была статистически значимой.

Этот протокол может использоваться в будущих крупномасштабных кампаниях по отбору проб eDNA для изучения морского биоразнообразия или генетики популяций китов. Этот протокол позволяет неинвазивно обнаруживать и контролировать китообразные и сопутствующие таксоны с помощью eDNA, содержащейся в флюкпринтах, собранных с судов для наблюдения за китами.