Создание модели мышей с ранней гестационной материнской иммунной активацией для оценки пренатального воспаления при нейроразвитии

Наша лаборатория изучает, как пренатальное воспаление меняет биологию микроглии — иммунных клеток мозга, способствующих неблагоприятным нейроразвитийным последствиям. Существующие модели MI ориентированы на стадию зарождаемости. Однако мы предлагаем ранний гестационный протокол, который также включает метрики контроля качества для повышения выживаемости и стабильности.

Модель может быть применена к любому дикому типу или генетической модели мышей для изучения влияния воспаления окружающей среды на развитие мозга. Для начала установите две мыши C57 BL6 возрастом от 8 до 10 недель с самцами C57 BL6 в поздний день или вечером. На следующее утро осмотрите самок мышей на наличие вагинальных пробок и продолжайте проверять один раз в день, пока не произойдёт закупорка.

Пробки временные и могут выпасть к полудню, если не проверить утром. После подтверждения вагинальной пробки взвесьте самку мыши и запишите вес для отслеживания состояния беременности, отслеживая набор веса во время беременности. Разделить забитых самок по отдельным клеткам и содержать их в стандартных условиях с доступом к еде и воде ad libidum.

Назначьте закупоренных женщин на эмбриональный день 0,5 и запишите дату установки вагинальной пробки для точного отслеживания гестационного возраста. Для восстановления лиофилизированного поли IC в раствор с высокой концентрацией его растворите в стерильном физиологическом растворе или стерильной воде согласно инструкциям производителя. Вихрь — раствор с высокой концентрацией запаса.

Затем разведите раствор в физиологическом растворе, чтобы получить бульон с низкой концентрацией. Чтобы избежать повторных циклов замораживания, наливайте примерно 125 микролитров запаса низкой концентрации в трубки объемом 1,5 миллилитра и храните трубки при 20 или 80 градусах Цельсия. Непосредственно перед инъекцией в эмбриональный день 9,5.

Разведите низкоконцентрационный поли-IC запас стерильным физиологическим раствором для получения рабочей концентрации. Нагрейте рабочий материал при 65 градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы обеспечить правильное реанилинг структуры двойной рибонуклеиновой кислоты. Затем вихрь или пипетка раствора для обеспечения однородной смеси перед введением.

Чтобы подтвердить беременность, взвесьте мать утром эмбрионального дня 9,5. Рассчитайте объём инъекции поли-IC для активации иммунитета матери (MIA) и объём инъекции физиологического раствора 0,9% для контроля. В стерильный шприц калибра 27 калибра и меньше введите подходящий объём подготовленного рабочего раствора поли-IC или физиологического раствора.

Теперь правильно закрепите плотину, чтобы минимизировать боль и страдания. Вводите поли-IC кислоту или физиологический раствор внутрибрюшнически в нижний левый или правый квадрант чуть выше уровня бедра или во второй паре сосков. Затем утилизируйте шприцы в контейнер BioSafety Sharps.

Также записывайте инъекцию, чтобы сохранить стабильность по всей когорте. Немедленно возвращайте плотину в домашнюю клетку и следите за признаками беспокойства. Затем дополните клетку гидрогелем не менее 24 часов после инъекции, чтобы предотвратить обезвоживание, связанное с поведением болезни.

После этого запишите объём введения дозы поли-IC, дату и время инъекции, гестационный возраст и номер партии поли-IC. Через три часа после инъекции наблюдайте за каждой мышью индивидуально в течение одной минуты и оценивайте поведение, такое как снижение активности, сгорбленная осанка, гримаса на лице или водянистый стул с помощью трёхбалльной шкалы. Классифицируйте мышей, проявляющих одно или несколько таких поведения, как проявленные острые болезни.

Затем, используя минимально инвазивный метод, например, кровоточение из хвоста, аккуратно собирайте материнскую кровь с введённой матери. Соберите примерно 50 микролитров крови. После подтверждения гемостаза верните плотину в домашнюю клетку.

Дайте собранной крови свернуться в течение 30 минут при комнатной температуре. Центрифугуйте образец при 2000 G в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы отделить сыворотку от сгустка. После повторного центрифугирования образца аккуратно соберите прозрачный верхний слой сыворотки, не нарушая сгусток.

Храните сыворотку при 20 градусах Цельсия, пока она не будет готова к анализу цитокинов по следующему потоку. После инъекции взвешивайте плотинки ежедневно в течение трёх дней, чтобы отслеживать реакцию на полиIC-кислоту. В день ожидаемых родов фиксируйте результаты помёта, включая размер помёта, жизнеспособность щенка или отсутствие помёта, чтобы указывать на неудачную беременность.

Немедленно удалите всех умерших щенков и утилизируйте их в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Используйте ELISA или мультиплексные анализы для количественной оценки воспалительных цитокинов, таких как IL-6 и TNF-альфа, в материнской сыворотке после MIA или контрольные инъекции по инструкциям производителя. После количественной оценки используйте результаты для установления репрезентативного порога для ответа MIA.

Наконец, проведите статистический анализ с помощью нашего программного обеспечения для оценки связи между уровнем IL-6 в сыворотке матери и TNF альфа. После введения поли IC на эмбриональный день 9,5 у MIA DAM был значительно повышен уровень IL-6 по сравнению с контрольными плотинами. Уровни ФНО-альфа показали сильную положительную корреляцию с уровнем IL-6 у матери.

С эмбрионального дня 0,5 до 9,5 эмбрионального дня матери, успешно родившие помёт, набирали значительно больше веса, чем те, у которых не было помёта. На следующий день после инъекции дамбы MIA похудели, а контрольные, обработанные физиологическим раствором, набрали вес. Но к 12-му эмбриональному дню обе группы показали схожий набор веса.

Вес до беременности не влиял на эффективность помёта ни в контролируемых солевом растворе, ни в дамах MIA. Однако мыши C57 BL6, полученные из Jackson Labs, имели более успешные выводки, чем мыши C57 BL6, полученные из Чарльз-Ривер во время процедуры MIA. В отличие от этого, источник поли IC не влиял на эффективность наполнителя.

Кроме того, животные, полученные из лабораторий Джексона, имели более сильный материнский воспалительный ответ, измеряемый сывороткой IL-6, по сравнению с животными, полученными из Чарльз-Ривер. В отличие от этого, воспалительная реакция матери была одинаковой у разных источников поли ИК. Протокол позволяет воспроизводимо генерировать раннюю модель MIA и корреляцию тяжести воспаления матери с экспериментальными результатами потомства. Крайне важно вести подробные записи, отслеживать количество реактивов и оценивать реакцию материнских цитокинов во всех дамбах, чтобы обеспечить воспроизводимые результаты.