Картирование морфологии звёздчатых клеток печени в мышиных моделях фиброза печени

Этот протокол представляет собой комплексный конвейер визуализации для визуализации и моделирования морфологии звёздчатых клеток печени в целостной ткани печени. Современная двумерная визуализация пропускает полную морфологию звёздчатых клеток, что ограничивает структурные и функциональные инсайты. Этот протокол позволяет надёжно захватывать сложную 3D-архитектуру.

Для начала зажмите ладони анестезиированной мыши, чтобы обеспечить правильную анестезию. Распылите живот 70% этанолом, чтобы смочить шерсть. С помощью щипцев поднимите кожу в центре живота, выровненную с задними лапами, и начните разрезать кожу, чтобы показать живот.

Затем используйте ватные палочки, смаченные PBS, чтобы сдвинуть кишечник и другие органы в сторону и поднять левую долю. Аккуратно разрежьте мембрану, прикреплённую между левой долей и хвостатой долями. Затем с помощью шва завязывает верхнюю часть левой доли.

Отрежьте левую долю ниже шовного узла и отложите её для сбора и обработки образцов ткани. Используйте ватные палочки, смоченные PBS, чтобы переместить печень и показать портальную вену. Затем аккуратно введите иглу катетера в портальную вену примерно на полпути длины.

Удалите иглу катетера. Обеспечьте обратный поток крови через катетер, чтобы показать успешное введение. Подключите заполненную трубку от действующего перфузионного насоса к катетеру и пропустите печень 20 миллилитрами PBS.

Зажмите легочную артерию над печенью гемостатом, чтобы остановить проход PBS через сердце. Перережьте нижнюю полую вену, чтобы освободить накопленное давление. Отрегулируйте скорость насоса до пяти миллилитров в минуту.

Через 15 минут остановить насос, чтобы заменить резервуар на 4% параформальдегида, затем перфузировать печень 25 миллилитрами 4% параформальдегида. После завершения перфузии удалять печень из окружающих органов, разрезав соединяющие ткани. Поместите печень в коническую трубку объёмом 50 миллилитров, заполненную 25 миллилитрами 4% параформальдегида.

Поставьте трубу горизонтально на платформу с раскачиванием скамейки на ночь в холодной комнате при температуре 4 градуса Цельсия при 1,5 оборота в минуту. На следующий день три раза промой печень в PBS на платформе для раскачки по 30 минут при комнатной температуре при 1,5 оборота в минуту. Пересадите печень в 20 миллилитров PBS с 0,02% азида натрия и храните при 4 градусах Цельсия.

Разрежьте образцы печени на части размером примерно 0,5–1 кубический сантиметр. Переложите образцы печени в стеклянные флаконы с крышками с винтовыми крышками. Обезвоживайте образцы в серии метанола, разбавленных водой, с 20% до 80% на колесном вращателе с восемью оборотами в минуту по одному часу при комнатной температуре.

После проведения отбеливания, проницаемости, иммуномаркировки и очистки образца инкубировать образец в дибензилэфире ночью при комнатной температуре перед визуализацией. Образцы можно хранить в дибензиловом эфире до одного года без потери сигнала окрашивания. Для конфокальной визуализации поместите очищенный образец в 35-миллиметровую чашу с стеклянным дном и дном с номером 1,5.

Наполните блюдо этил-циннаматом, чтобы полностью погрузить образец. Затем поставьте тарелку на сцену конфокального микроскопа. Получите изображение плитки на самой яркой плоскости, чтобы захватить большую область образца в формате 1024 на 1024 с скоростью 600.

Исходя из изображения плитки, выберите интересующие области для сбора Z-скана с более высоким разрешением. Далее получите Z-стек, охватывающий всю глубину очищенной ткани с максимальным разрешением, поддерживаемым микроскопом в формате 1024 на 1024 и скорости сканирования 600. Успешная перфузия и фиксация печени мыши привели к равномерному бледно-бежевому жёлтому цвету.

Неправильная перфузия приводила к образованию тёмно-красных или коричневых участков тромбов, что снижало оптическую чёткость и приводило к высокому фоновым сигналам в этих областях. Полная оптическая прозрачность была достигнута после инкубации в дибензильном эфире, когда ткань казалась прозрачной по сравнению с предыдущим очищением. Высокоразрешённые Z-стеки выявили тонкие дендритные процессы, простирающиеся от тела отдельных клеток печёночного звёздчатого тела.

Как контрольные, так и хронические образцы печени тетрахлорида углерода показали сильные и стабильные флуоресцентные сигналы при конфокальной микроскопии. Этот конвейер воспроизводимо отображает морфологию звёздчатых клеток в сложном сервере микросреды, фиксируя дендритные процессы и пространственные связи с соседними клетками. Затраты времени — важный фактор при выполнении протокола.

Процесс очистки занимает примерно три недели, что требует предварительного планирования. Обеспечивая точный 3D-морфометрический анализ, эта платформа связывает структуру фибробластов с функциями, расширяя понимание гомеостаза тканей и Z-механизма.