Выделение и очистка островков поджелудочной железы у крыс Льюиса с помощью ферментативного расщепления и разделения плотностно-градиентного разделения
3 апреля 2026 г.
Этот протокол описывает стандартизированный метод хирургического сбора, ферментативного пищеварения и плотно-градиентной очистки островков поджелудочной железы крыс Льюиса, что позволяет создавать высокоэффективные и чистые препараты для прямого использования при трансплантации или исследованиях in vitro .
Наши исследования сосредоточены на разработке стандартизированного высокопроизводительного протокола изоляции люверса Lewis Rat для оптимизации выхода, чистоты, жизнеспособности и функциональной долговечности. Существующие методы дают переменные нечистые кратковременные люверсы. Этот протокол стандартизирует пищеварение, очистку и объединение для повышения стабильности и долговечности.
Для начала поместите усыпленную крысу под микроскоп. С помощью кожных ножниц сделайте V-образный разрез, начиная от лобкового синтеза к каждой боковой грудной клетке, чтобы получить доступ к брюшной полости. С помощью плоских щипцов оттяните тонкую и толстую кишку на левую сторону животного, чтобы освободить рабочее пространство в брюшной полости.
Затем используйте плоские щипцы и изогнутые гемостаты, чтобы развернуть верхнюю двенадцатиперстную область. Убедитесь, что общий желчный проток и печеночная портальная вена находятся в поле зрения. Теперь используйте изогнутые гемостаты, чтобы втянуть печень в сторону кефалона.
Зажмите общий желчный проток и печеночную вену в одном-двух миллиметрах от печени. Под микроскопом, с помощью плоских щипцов и плоских гемостатов, аккуратно мобилизуйте содержимое внутри двенадцатиперстной кишки, чтобы очистить сфинктер от ауди. Затем аккуратно зажмите двенадцатиперстную кишку примерно на пять миллиметров от каждой стороны сфинктера ауди, чтобы изолировать окружающую область.
Обеспечивайте минимальное сжатие для сохранения целостности тканей. Аккуратно введите иглу шприца с стерильным WDM через стенку двенадцатиперстной кишки. Пропустите иглу через тело сфинктера и продвигайте её в главный проток поджелудочной железы для перфузии.
Сохраняя постоянное давление, пропустите 7–10 миллилитров WDM в поджелудочную железу со скоростью около 500 микролитров в секунду, пока поджелудочная полностью не расширится. Теперь удалите оба плоских гемостата из двенадцатиперстной кишки. Затем аккуратно вскрыть и освободить поджелудочную железу от окружающих структур, начиная с селезёнки, желудка, толстой кишки, двенадцатиперстной кишки и мезентария.
Аккуратно поднимите перфузионную поджелудочную железу плоскими щипцами и используйте тонкие ножницы для препарирования, чтобы разрезать оставшиеся соединительные ткани. Немедленно переложите вырезанную поджелудочную в чашку Петри с ледяным раствором для промывания и приступите к сбору следующей поджелудочной железы, пока её очищают. Для очистки поджелудочной железы используйте пару тонких изогнутых щипцев и тонкие ножницы для рассечения, чтобы аккуратно удалять лимфатические узлы, жировую ткань, мезентарные и крупные сосудистые органы из перфузировавшей поджелудочной железы, если они есть.
Переложите очищенную поджелудочную железу в стерильный стакан на 600 миллилитров с 25 миллилитрами холодного WDM. Накройте стакан стерильной алюминиевой фольгой, чтобы сохранить чистоту при переносе из операционного помещения в рабочее место для культуры клеток. Переведите стакан в орбитальный шейкер, установленный на 130 оборотов в минуту на 10 минут.
На пятой минуте вручную поверните стакан по часовой стрелке, а затем против часовой, чтобы помочь тканевой диссоциации. На 10-й минуте быстро переместите стакан и погрузите его в лёд, чтобы замедлить активность фермента. Затем добавьте равный объём буфера для закалки в раствор в стакане, чтобы остановить пищеварение.
Используя 50-миллилитровый шприц, оснащённый спиной 14-го калибра, аккуратно аспирируйте и многократно выводите тканевую суспензию, чтобы диссоциировать крупные фрагменты ткани. Перенесите подвеску в конические трубки объемом 200 миллилитров. После центрифугирования суспензии аккуратно декантуйте супернатант и снова суспензируйте гранулу в 100 миллилитрах промывального материала.
Теперь профильтруйте суспензию через стерильное сито объемом 500 микрометров, установленное поверх стерильного стакана объёмом 600 миллилитров, чтобы удалить крупную непереваренную ткань. Перенесите фильтрат в новые конические трубки объемом 200 миллилитров перед повторным центрифугированием. Для очистки отверса используйте заранее склеенную серологическую пипетку объёмом 10 миллилитров, чтобы повторно суспензировать каждую тканевую гранулу в 15 миллилитрах градиентного раствора на два миллилитра объёма гранулы.
Аккуратно перемешивайте, пока подвеска не станет однородной. Аккуратно вливайте 15 миллилитров суспензии ячейки в дно каждой 50-миллилитровой конической трубки, избегая контакта со стенками трубки для обеспечения чистого градиента. Затем с помощью шприцового насоса нанесёт по 10 миллилитров каждого градиента со скоростью пять миллилитров в минуту, при этом кончик иглы 16-го калибра прижимается к внутренней стенке трубки, чтобы предотвратить смешивание.
После центрифугирования трубок определите слой люверса, расположенный на границах между градиентными слоями. С помощью пипетки с уходом соберите слой отверса, переложите собранные люверсы в заранее охлаждённую коническую трубку объемом 200 миллилитров с пятью миллилитрами средство для мытья. Поднимите объём до 200 миллилитров с помощью стирального средства и выполните следующие этапы промывания и центрифуга.
Затем равномерно размещуйте люверсы в 100-миллиметровую чашку Петри, обработанную не тканевой культурой, используя одну тарелку на каждые пять обработанных поджелудочной железы. По всей тестовой изоляции выход составлял 3 330 эквивалентов на одну поджелудочную железу с медианным диаметром отверстия в контейнере площадью 50–100 микрометров. Автоматизированное измерение дало 98 832 объекта, что сильно коррелировало с ручными эквивалентами век, измеренными на нулевый день.
Эндокринная чистота составляла около 98,56% на основе дитозонного окрашивания на первый день. Индексы стимуляции составляли 9,37 на первый день, 8,34 на третий и 6,7 на седьмой день без значительных различий между временными точками. Этот метод позволяет изучать трансплантацию глазца, функцию бета-клеток, обратить диабет, инкапсуляцию глаз и взаимодействия с иммунным или микроокружением.
Этот протокол может применяться к доклинической трансплантации, моделированию диабета, исследованиям инкапсуляции и инвитро функциональным анализам, требующим высокочистых люверсов Lewis Rat.
Обзор
В данной статье подробно описан стандартизированный высокопроизводительный протокол выделения островков поджелудочной железы у крыс линии Льюис, разработанный для обеспечения максимального выхода, чистоты, жизнеспособности и функционального долголетия. Метод объединяет хирургический забор органов, ферментативное переваривание и очистку методом центрифугирования в градиенте плотности, что позволяет эффективно подготавливать высококачественные островки, подходящие как для доклинических исследований диабета, так и для исследований по трансплантации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология островков
- Исследование диабета
- Наука о трансплантации
- Методы изоляции клеток
Теоретические основы
- Островки поджелудочной железы имеют решающее значение для исследований диабета и трансплантации.
- Существующие методы изоляции часто позволяют получить вариабельные, неочищенные и недолговечные островки.
- Новые методы терапии требуют получения более крупных, чистых и стандартизированных препаратов островков.
- Стандартизация необходима для повышения воспроизводимости и улучшения функциональных результатов.
Цель исследования
- Разработать воспроизводимый высокопроизводительный протокол выделения жизнеспособных панкреатических островков высокой степени чистоты из крыс линии Lewis.
- Оптимизировать выход и функциональную долговечность островков для использования в исследованиях и трансплантации.
- Минимизировать ручные манипуляции и вариабельность при подготовке препаратов островков.
Используемые методы
- Хирургическое обнажение и перфузия поджелудочной железы через главный панкреатический проток с использованием стерильного буфера.
- Ферментативное переваривание в водяной бане на орбитальном шейкере с последующим гашением реакции и механической диссоциацией.
- Фильтрация и центрифугирование в градиенте плотности для очистки островков.
- Количественное определение с помощью ручного подсчета аликвот и полуавтоматического получения изображений всего препарата.
- Оценка чистоты путем окрашивания дитизоном, а также жизнеспособности и функции с помощью анализа секреции инсулина, стимулированной глюкозой.
Основные результаты
- Ручной подсчет дал примерно 3 300 эквивалентов островков (IEQ) и 2 700 абсолютных островков на одну поджелудочную железу (~39 600 IEQ всего из 12 поджелудочных желез).
- Автоматизированный анализ показал в общей сложности 16 350 IEQ (1 362 IEQ/поджелудочная железа), что подчеркивает вариабельность количественной оценки.
- Распределение островков по размеру: 62% (50-100 μm), 17% (100-150 μm), 10% (150-200 μm), 5% (200-250 μm), 6% (>250 μm).
- Чистота составила примерно 98% по результатам окрашивания дитизоном; жизнеспособность in vitro на 3-й и 7-й дни оставалась на уровне 98%.
- Функциональная оценка показала 9-10-кратное увеличение секреции инсулина при стимуляции глюкозой, которое сохранялось в течение 7 дней.
Выводы
- Данный протокол позволяет эффективно и воспроизводимо выделять жизнеспособные и функционально полноценные островки высокой чистоты из поджелудочной железы крыс линии Lewis.
- Островки остаются пригодными для анализов in vitro и трансплантации in vivo в течение семи дней после выделения.
- Метод подходит для крупномасштабных исследований в области моделирования диабета, трансплантации, инкапсуляции и биологии островков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Стандартизированная высокопроизводительная изоляция островков поджелудочной железы у крыс линии Lewis устраняет критическое узкое место в исследованиях диабета и доклинических исследованиях трансплантации. Данный протокол позволяет получать воспроизводимые, высокочистые и функционально стабильные препараты островков, что обеспечивает масштабируемость рабочих процессов in vitro и in vivo. Надежное снабжение островками повышает прогностическую достоверность и позволяет осуществлять риск-ориентированное продвижение в рамках ранних этапов поиска и трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать функцию бета-клеток и механизмы развития диабета в контролируемых системах, имеющих значение для данной патологии.
- Способствует снижению биологических рисков, обеспечивая получение стабильных, высокоочищенных островков для механистических исследований.
- Облегчает функциональную валидацию мишеней с помощью надежных анализов глюкозостимулированной секреции инсулина.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных препаратов островков для воспроизводимого скрининга соединений и разработки анализов.
- Снижает вариативность ручного труда, обеспечивая количественные и масштабируемые результаты анализов.
- Подготавливает валидированные биологические системы для последующего использования на платформах высокопроизводительного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Обеспечивает возможность доклинической трансплантации и моделирования диабета с использованием функционально сохранных островков.
- Обеспечивает преемственность от функциональных анализов in vitro к исследованиям эффективности in vivo.
- Соответствует стратегиям трансляционного поиска биомаркеров за счет поддержания жизнеспособности и функции островков в течение времени.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол интегрирован в цикл от этапа открытия до доклинических исследований, создавая основу для идентификации перспективных соединений, снижения механистических рисков и трансляционной валидации в исследованиях диабета.
- Поисковая биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей с использованием высококачественных островков.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные показатели для оценки соединений и стандартизации анализа.
- Аналитика: Предоставляет ручные и полуавтоматические методы количественного определения для надежного сравнения данных.
- Трансляционные исследования: Сохраняет функцию и жизнеспособность островков для доклинической трансплантации и сопоставления биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Устанавливает масштабируемый, воспроизводимый рабочий процесс для текущих исследований диабета и биологии островков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает неопределенность механизмов в моделях диабета.
- Практическая ценность: стандартизирует изоляцию островков, улучшая воспроизводимость и масштабируемость исследований.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о целесообразности дальнейших разработок и повышает эффективность использования капитала за счет обеспечения надежности биологических исходных данных.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию с учетом рисков и развитие программ исследований диабета.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области хирургических методов и ферментативной обработки тканей.
- Необходим доступ к специализированному оборудованию для перфузии, градиентного разделения и количественного анализа на основе визуализации.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Адаптация метода для других линий грызунов может потребовать оптимизации и валидации протокола.
- При планировании эксперимента следует учитывать вариабельность выхода и количественных показателей при использовании ручных и автоматизированных методов.
