Протокол диссоциации отдельных клеток, секвенирования РНК и изоляции миоэпителиальных клеток и фибробластов из старых слёзных и слюнных желез

Моя лаборатория изучает, как возрастные изменения слюнных и слёзных желез влияют на разные типы клеток, используя проточную цитометрию и секвенирование одноклеточной РНК. Стандартные методы диссоциации плохо восстанавливают хрупкие эпителиальные клетки из старых слюнных и слёзных желез. И мой протокол повышает жизнеспособность клеток и обеспечивает надёжный анализ и сортировку клеток по одной клетке.

Для начала разместите эвтаназированную мышь на спине на столе для вскрытия. С помощью тонких щипцов и ножниц разрезайте кожу между глазом и ухом. Аккуратно оттяните кожу, чтобы открыть слёзную железу.

С помощью тупых щипцов слегка приподнимите слёзную железу. Аккуратно отделяйте окружающую соединительную ткань, аккуратно дразнив её круговым движением. Определите видимые границы слёзной железы и отдельте её от соседних тканей, включая околоушную железу.

Затем перенесите слёзную железу в 35-миллиметровую чашку Петри с двумя миллилитрами холодного PBS на льду. Под расщепляющим микроскопом удалите оставшийся жир и аккуратно извлеките соединительную тканевую капсулу из слёзной железы. Поставьте стерильную чашку Петри диаметром 35 мм на лёд.

Добавьте 800–1000 микролитров холодного PBS в центр тарелки и перенесите одну слезную железу в PBS. Убедитесь, что ткань остаётся погружённой в PBS. Используя два стерильных скальпеля, мелко измельчите слёзную железу на мелкие фрагменты, пока она не достигнет мягкой пастообразной консистенции.

Соберите фрагменты ткани с одной стороны тарелки. Аспирируйте остатки PBS и промой фрагменты одним миллилитром свежего холодного PBS. Переместите промытые фрагменты ткани в пластину с 12 лунками, содержащую по два миллилитра предварительно нагретой среды на каждую яму.

Поставьте тарелку в встряхивающую водяную ванну и инкубуйте при 37 градусах Цельсия и 60 оборотах в минуту в течение 30 минут. Используя ширококалиберный наконечник пипетки объёмом один миллилитр, аккуратно тритурируйте ткань 15 раз. Верните тарелку в встряхивающую водяную ванну и инкубуйте ещё 30 минут.

Далее, используя обычный наконечник пипетки объёмом один миллилитр, аккуратно тритурируйте образец 10 раз и снова инкубируете в течение 30 минут. Затем аккуратно тритурируйте образец 10 раз и перенесите суспензию клетки в двухмиллилитровые микроцентрифугные трубки дельфина. Добавьте по миллилитру холодно-блокирующего средства один, или BM1, в каждую яму, чтобы собрать оставшуюся пищеварительную среду с остаточными клетками, и положите пластину на лёд до следующего этапа.

Центрифугуйте трубки с подвешенностью ячейки при температуре 300 G в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия. Сбросьте супернатант из каждой трубки. Переместить BM1 из каждой ямы пластины, содержащей остаточные клетки, в соответствующую трубку.

Далее добавьте 600 микролитров холодного BM1 в каждую яму, чтобы промыть оставшиеся клетки, и переложить промывку в соответствующую трубку для соединения с суспензией ячейки. Аккуратно подвесьте подвеску ячейки. Центрифугуйте трубки снова при 300 G в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия и выбросьте супернатант.

Добавьте один миллилитр аккутазы к клеточным гранулам и аккуратно подвесьте клетки. Инкубировать трубку при 37 градусах Цельсия и 60 оборотах в минуту в течение пяти-десяти минут. Используя наконечник пипетки объемом один миллилитр, аккуратно тритурируйте образец 10 раз.

Затем добавьте в трубку один миллилитр холодного BM2, чтобы прекратить ферментативную реакцию, разбавляя аккутазу. Центрифугуйте трубку при 300 G в течение пяти минут при четырёх градусах Цельсия и сбросьте супернатант. Добавьте в трубку среду с DNазой 1 в концентрации 200 единиц на миллилитр, чтобы вновь взвесить клетки и заполнить трубку сверху.

Инкубируйте трубку 10 минут при комнатной температуре, а через пять минут аккуратно подвесьте один раз. Тем временем поставьте 70-микрометровый фильтр на 15-миллилитровую коническую трубку и предварительно смочите сито одним миллилитром BM3. После инкубации перенесите подвеску клеток на сито.

Добавьте миллилитр BM3 в оригинальную трубку для сбора и переложите промывку на то же сито. Промой сито дополнительно пятью миллилитрами BM3. Наконец, определите концентрацию клетки и жизнеспособность фильтрованной суспензии с помощью трипан-синего окрашивателя и автоматического счётчика клеток.

Переходите к следующим приложениям, таким как секвенирование одноклеточных РНК для профилирования экспрессии генов или сортировка клеток на основе флоу-цитометрии флуоресцентно маркированных клеточных популяций. Анализ UMAP данных секвенирования одноклеточной РНК выявил хорошо представленные эпителиальные и стромальные популяции в слёзной железе, включая миоэпиттелиальные клетки и фибробласты, а также разнообразные популяции иммунных клеток. Старые слезные железы содержали обильное количество плазмы и активировали B-клетки, экспрессирующие IGHM и IGHD.

Последовательное цитометрическое гейтинг позволило чётко отделить EpCAM-положительные, GFP-положительные миоэпиттелиальные клетки от EpCAM-отрицательных, GFP-положительных муральных клеток. GFP-положительные фибробласты, экспрессирующие PDGFR альфа, были EpCAM-отрицательными, что позволяло различать по эпителиальным клеткам. У мышей PDGFR альфа и EGFP все GFP-положительные клетки также экспрессировали коллаген один, что подтверждает идентичность фибробластов.

Анализ потоковой цитометрии показал, что 99,6% клеток-положительных к GFP соответствовали иммунокрашенным клеткам PDGFR альфа. Этот протокол предназначен для выделения жизнеспособных отдельных клеток из слёзных желез с целью молекулярной характеристики эпителиевых, стромальных и иммунных популяций. Основная задача — минимизация механического и ферментативного стресса при рассоединении хрупкой старой ткани, а также поддержание высокой жизнеспособности клеток для секвенирования одноклеточной РНК.

После этой процедуры изолированные клетки могут использоваться для секвенирования одноклеточной РНК, массового секвенирования РНК и молекулярного профилирования определённых популяций клеток. Отсортированные клетки также можно культивировать для дальнейших функциональных анализов.