Синтез, инкапсуляция гемоглобина и биортогональная ПЭГилирование в иерархически пористых наночастицах UiO-66 для доставки кислорода

Цель данного исследования — определить стабильные металло-органические каркасные структуры, наночастицы на основе MOF, для инкапсуляции гемоглобина и доставки кислорода. Иерарх-пористый морф может преодолеть ограничение размера после инкапсуляции гемоглобина, а поверхностная популяция может повысить стабильность частиц в физиологических условиях. Для начала точно взвесьте 50 миллиграммов подготовленных иерархически пористых наночастиц UIO 66 в колбу с круглым дном объемом 25 миллилитров.

Добавьте в колбу 10 миллилитров тетрагидрофурана. Затем ультразвуковой обработкой смеси в течение пяти минут, чтобы частицы полностью рассеивались, создавая равномерную непрозрачную суспензию. Поместите круглую колбу в ледяную водяную ванну на магнитную мешалку, установленную на 400 об/мин.

Используя стеклянный шприц, добавляйте 0,4 миллилитра третбутилнитрита по каплям в течение пяти минут, поддерживая температуру ниже пяти градусов Цельсия. Немедленно добавляйте 0,35 миллилитра триметил-азида SL по каплям в тех же холодных условиях. Может появиться лёгкое шипение, указывающее на прогрессирование нитрозации.

Затем оберните водяную ванну с льдом алюминиевой фольгой, чтобы защитить реакцию от света. Продолжайте перемешивать реакционную смесь в ледяной водяной бане на ночь. На следующий день постирайте и сушите продукт, как показано.

Затем используйте спектроскопию FTIR для проверки химического превращения. Перенесите пять миллиграммов иерархически пористых наночастиц UIO 66 азида в двухмиллилитровую центрифугную трубку. Добавьте 0,5 миллилитра буфера HEPES и соник в течение двух-пяти минут.

Добавьте 0,5 миллилитра буфера HEPES с содержанием 20 миллиграммов на миллилитр гемоглобина и аккуратно перевернуйте трубку несколько раз, чтобы полностью рассеять наночастицы. Теперь поставьте трубку на термошейкер и инкубуйте при комнатной температуре с встряхиванием при 1000 об/мин в течение двух часов. После инкубации центрифугуйте трубку при 13 500 G в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать гемоглобин, нагруженные иерархически пористыми наночастицами UIO 66 азида.

Затем аккуратно возьмите супернатант для количественной оценки незадержанного гемоглобина. Аккуратно промыйте гранулу три раза с помощью одного миллилитра ультрачистой воды, проводя пипетом вверх и вниз, чтобы удалить слабо впитанный гемоглобин. Затем аккуратно соберите супернатант каждого промывки для количественной оценки задержанного гемоглобина.

Заново суспензируйте финальную гранулу в 0,5 миллилитрах ультрачистой воды и храните в холодильнике перед характеристикой. Используйте анализ на суглобат натрия лавровой гемоглобина для определения захваченных гемоглобина в собранных супернатантах. Пипетте по 10 микролитров каждого супернатанда в 96-лунную микропластину.

Добавьте 100 микролитров реагента сульфата натрия и лаврового сульфата и инкубируем пять минут при комнатной температуре в темноте. С помощью ультрафиолетового видимого спектрофотометра измеряйте поглощение на 412 нанометров. Затем подготовьте серийное разбавление запаса гемоглобина в буфере HEPES для получения стандартной кривой.

Переместите подготовленные разбавления в подготовленную пластину на 96 лунок для создания стандартной кривой для преобразования показаний поглощения в концентрации гемоглобина. Перенесите 10 миллиграммов наночастиц гемоглобина, наполненного иерархически пористыми UIO 66 азидом, в двухмиллилитровую центрифугную трубку, содержащую 0,5 миллилитра ультрачистой воды и сониката, на две-пять минут. Добавьте 20 миллиграммов дибензоциклоктана, модифицированного полиэтиленгликолем, чтобы получить эквимолярное соотношение полиэтиленгликоля к наночастицам.

Аккуратно закрутите трубку, пока смесь не станет гомогенизированной. Поставьте трубку на термошейкер и инкубуйте при комнатной температуре, встряхивая при 1000 об/мин в течение одного часа. Затем переместите трубку в холодильник, поддерживаемый при температуре четырёх градусов Цельсия, для ночной реакции.

Центрифугуйте трубку при 12 000 G в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы пелетировать наночастицы UIO 66, модифицированные полиэтиленгликолем, нагруженными гемоглобином, иерархически пористые. Затем отбрасывают супернатант, содержащий нереактивный полиэтиленгликоль. Промыйте гранулу три раза двухмиллилитровой ультрачистой водой, протягивая трубой вверх и вниз и центрифугировав в тех же условиях, что были показаны ранее.

Суспензировать очищенные наночастицы полиэтиленгликоля UIO 66 с нагруженным пегилированным гемоглобином в двух миллилитрах сверхчистой воды. Храните подвеску при четырёх градусах Цельсия. Получившийся коллоид выглядит однородным и слегка опалесцентным, что указывает на хорошую устойчивость дисперсии.

Затем подтвердите успешное пеилирование с помощью динамического рассеяния света, или DLS. Поверхностные аминогруппы были успешно преобразованы в азиды. Это было продемонстрировано появлением характерного асимметричного азида, растягивающегося полосой на 2 122 инверсных сантиметра в спектре FTIR иерархически пористых наночастиц UIO 66 азида.

Эта полоса отсутствовала в иерархически пористых наночастицах аминов UIO 66. Инкапсуляция гемоглобина визуально отмечалась явным переходом цвета от жёлтого к красному. Поглощение азота снижалось после загрузки гемоглобина, что указывает на занятие мезопор молекулами гемоглобина.

Дзета-потенциал иерархически пористых UIO 66 азидных наночастиц снизился с 42,9 милливольт до 20,4 милливольт после инкапсуляции гемоглобина. Успешная конъюгация полиэтиленгликоля была подтверждена исчезновением вибрации азидов, растягивающих их на 2122 инверсных сантиметрах, а также появлением сигналов, связанных с полиэтиленгликолем, в спектре FTIR. Анализ DLS показал увеличение гидродинамического диаметра примерно с 114,9 до 140,8 нанометра после пегилирования, при сохранении низкого PDI.

Эта частица позволяет синтезировать иерархически пористые морфные наночастицы, инкапсулировать гемоглобин, пекуляцию поверхности и оценивать функцию высвобождения кислорода. С помощью этого протокола можно провести дополнительную физико-химическую характеристику и функциональные исследования, включая анализ in vitro высвобождения кислорода и биосовместимости наночастиц. Будущие исследования могут быть сосредоточены на сохранении функции гемоглобина для более длительных целей, например, на включении компонентов для предотвращения существенного разрушения.