Использование растворённой ЯМР для характеристики биомолекулярных конденсатов в бифазных условиях
17 апреля 2026 г.
Здесь мы представляем протоколы для ЯМР-методологий, REstricted DIFfusion INvisible speciE (REDIFINE) и CONdensate DEtectioN с помощью SEmi-твёрдого магнитоносного переноса (CONDENSE-MT), которые позволяют без маркировки количественно характеризуть биомолекулярные конденсаты в бифазных условиях, раскрывая молекулярное распределение, динамику обмена, гидратацию конденсата и структуру капель без осадкения или маркировки.
Мы разработали методы ЯМР для изучения биомолекулярных конденсатов. Они ключевы для организации клеток, но их постоянная информация подразумевается при множестве расстройств. Используя наши методы, мы исследуем свойства конденсатного материала, анализируем механизм их образования и отслеживаем долгосрочные изменения, такие как созревание конденсата или патологическая фибрилляция биомолекул.
Для начала подготовьте финальный бифазный образец, стабилизированный агарозным гидрогелем, смешивая белковые запасы, РНК-запасы или оба с соответствующим тёплым агарозным буфером в микроцентрифуге объемом 1,5 миллилитра. Конечная концентрация белка, или РНК, обычно составляет от 50 до 500 микромоляров для обнаружения ЯМР. Вставьте подготовленный бифазный образец в спектрометр, затем зафиксируйте, подставите, сопоставьте и настройте протонный канал как обычно.
Калибруйте длину импульса под углом 90 градусов на протонном канале с помощью общей калибровочной процедуры. Затем запишите одномерный спектр, подавленный водой, и проверите, содержит ли спектр сильные биомолекулярные сигналы. Если сигнал отсутствует или очень мало, не переходите к применению REDIFINE, а используйте CONDENSE-MT.
Запишите эксперимент по диффузионной упорядоченной спектроскопии, чтобы распределить силу градиента диффузии от 2 до 95% за 16 линейных шагов. Чтобы продолжить сбор данных для полного набора REDIFINE, создайте девять новых экспериментов PPP GPQ S19, скопировав параметры из только что запущенного первоначального эксперимента. В каждом последовательном эксперименте изменяйте задержку диффузии D20 с переменными шагами, чтобы охватить диапазон от 100 до 1000 миллисекунд.
Запускайте каждый из этих экспериментов с подходящей командой. Используйте последний N, чтобы сохранить усиление приёмника на протяжении всех 10 экспериментов. Установите знак Q с функцией оконного режима SSB2.
Затем извлечь пятый срез с помощью соответствующей команды. Фазируйте одномерный спектр и сохраняйте параметры фазирования в двумерном наборе данных. Обрабатывайте двумерный набор данных с помощью XF2 и выполняйте коррекцию базовой линии с помощью ABS2.
После этого извлеките 16 ломтиков с помощью разделённого 2D. Повторите аналогичную процедуру для оставшихся девяти экспериментов. Проверьте как минимум первые четыре-пять срезов для правильного фазирования и коррекции базовой линии.
При необходимости исправьте фазирование и исходную линию. Затем используйте подходящий код MATLAB для анализа. В коде модифицировать время диффузии, установить значения PG в соответствии с силой градиента зонда и назначить эксперименты с одного по десятый на основе общего количества экспериментов.
Затем подгоняйте данные по модели REDIFINE с использованием этого кода. Запишите 1D-спектр подавления воды. Если сигнал наблюдается очень мало, приступайте к эксперименту CONDENSE-MT.
Определите скорость воды R1 с помощью восстановления по инверсии T1 для количественного CONDENSE-MT. Скопируйте предоставленную последовательность импульсов и список VD в соответствующие папки. После калибровки импульса протона на 90 градусов установите NS на 2, DS на 0, D1 на 20 секунд, SW на 10 частей на миллион.
TD2 до 16K и TD1 до 24. Для эксперимента CONDENSE-MT скопируйте предоставленный набор параметров, последовательность и частотный список Bruker в папки, соответствующие Bruker. Затем регулируйте частоты и мощность в зависимости от спектрометра.
Установите P1 на откалиброванную длину импульса 90 градусов и P4 на одну микросекунду для импульса возбуждения, чтобы избежать демпфирования радиации. Установите NS на 2, DS на 16, D1 на четыре секунды, SW2 на 20 частей на миллион, TD2 на 8k, а TD1 на длину списка частот. Установите SPNAM10 на Squa100 000, а P10 — на пять секунд.
Найдите мощность SP10, которая даёт 100 герц. Соответственно отрегулируйте мощность импульса облучения SP10. Запустите псевдодвумерный эксперимент с соответствующей командой и настройте серию таких псевдодвумерных экспериментов с изменяющей мощностью облучения SP10.
После настройки всех параметров запустите код для считывания ЯМР-спектров, которые интегрируют водяной сигнал и сохраняют его в новую переменную. При восстановлении инверсии кода скорректируйте путь к соответствующим данным и проверьте область интеграции воды. Затем корректируйте номер эксперимента, содержащий данные восстановления инверсии.
Задайте все экспериментальные параметры и введите значения пустого пула агарозы, ранее полученные путём аналогичной подгонки набора агароз. Запустите первый раздел конденсированного пустого кода, чтобы получить соответствие для продольной релаксации воды. Затем запустите раздел конденсирующего пустого фитинга, чтобы инициировать живую фигуру, показывающую минимизацию функции фитинга.
Запустите следующий раздел кода, чтобы определить неопределённости и построить график данных. Подгонка REDIFINE определяла коэффициенты диффузии в разбавленной и конденсированной фазах, популяцию белков в конденсированной фазе, средний размер капли и межфазную проницаемость для образца N-концевого домена FUS. ЯМР-сигнал N-терминального домена FUS оставался обнаруживаемым в конденсированной фазе.
Различий в профиле передачи намагниченности между эталонным агарозным и N-концным доменом FUS по фазовому образцу не наблюдалось. Для конденсатов повторяющихся РНК CAG ЯМР-сигнал не наблюдается. Соответственно, профиль передачи намагниченности значительно отличается от эталонного агарозного профиля.
Эксперимент CONDENSE-MT обеспечил динамическую характеристику конденсатов РНК с повторяющимся расширением. Анализ CONDENSE-MT выявил кинетику обмена протонами между конденсатом и объёмной водой. Анализ CONDENSE-MT также выявил время поперечного релаксации РНК в конденсате и кажущуюся поперечную скорость релаксации в объёмной воде.
В этом протоколе мы можем охарактеризовать свойства конденсата в бифазном состоянии без необходимости химической метки. Капли сосуществуют с разбавленной средой, что позволяет обмениваться между двумя фазами, имитируя клеточную среду. Наши методы, ориентированные на характеристику конденсата, могут быть дополнены традиционными методами ЯМР для изучения взаимодействий молекулярной структуры и динамики между фазами.
В будущих исследованиях мы планируем разработать более сложные модели конденсата, адаптировать методологию к более сложным системам и в конечном итоге изучать конденсат непосредственно в их внутриклеточных средах.
Обзор
Биомолекулярные конденсаты, образующиеся путем жидкостно-жидкостного фазового разделения (LLPS), играют ключевую роль в организации внутриклеточной среды и регуляции биохимических процессов. Характеристика состава, динамики и внутренней организации этих конденсатов представляет собой сложную задачу, особенно при отсутствии внешней маркировки. В данной статье представлены два взаимодополняющих метода ядерного магнитного резонансного (ЯМР) анализа, которые позволяют проводить комплексный анализ биомолекулярных конденсатов в их нативном двухфазном состоянии без использования меток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Структурная биология
- Биофизика
Теоретические основы
- Биомолекулярные конденсаты формируются посредством жидкостно-жидкостного фазового разделения (LLPS) и играют важную роль в организации клетки.
- Традиционные методы изучения конденсатов часто требуют использования внешних меток или тегов.
- ЯМР-спектроскопия предлагает метод без использования меток для исследования молекулярного движения и неоднородности микроокружения.
- Понимание свойств конденсатов необходимо для установления связи между их структурой, биологической функцией и развитием заболеваний.
Цель исследования
- Разработать и продемонстрировать методы на основе ЯМР для характеристики биомолекулярных конденсатов без использования внешних меток.
- Количественно оценить молекулярное распределение, динамику обмена и внутреннюю организацию конденсатов.
- Обеспечить многомерный количественный анализ структуры и динамики конденсатов в условиях, близких к нативным.
Используемые методы
- Метод ЯМР с обменом диффузии: ограниченная диффузия невидимых форм (REDIFINE).
- ЯМР с переносом намагниченности в полутвердое состояние с детектированием по воде: обнаружение конденсатов методом переноса намагниченности в полутвердое состояние (CONDENSE-MT).
- Измерение диффузионного контраста, химического обмена и релаксационного контраста.
- Анализ скоростей молекулярного обмена, размера капель, проницаемости интерфейса, динамики гидратации и содержания связанной воды.
Основные результаты
- Метод REDIFINE позволяет количественно определить долю молекул, распределенных между конденсированной и разбавленной фазами.
- Определение размера капель и проницаемости интерфейса с помощью измерений диффузии и обмена.
- Метод CONDENSE-MT позволяет отслеживать конденсаты по протонам объемной воды, выявляя динамику распределения и гидратации.
- Оба метода обеспечивают комплексную безмаркерную характеристику структуры и динамики конденсатов.
Выводы
- Интеграция методов REDIFINE и CONDENSE-MT расширяет инструментарий ЯМР для изучения биомолекулярного фазового разделения.
- Данные методы позволяют проводить количественный многомерный анализ конденсатов без необходимости использования флуоресцентных или других меток детекции.
- Этот подход создает основу для установления связи между физико-химическими свойствами конденсатов, их биологическими функциями и патологическими нарушениями регуляции.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Безметочная ЯМР-характеристика биомолекулярных конденсатов восполняет критический пробел на ранних этапах поиска новых мишеней, позволяя проводить количественный многомерный анализ фазово-разделенных ансамблей в условиях, близких к нативным. Эта возможность повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней и снижении механистических рисков, что способствует принятию обоснованных решений по портфелю проектов в ключевые моменты развития. Интеграция этих методов ЯМР в рабочие процессы поиска новых лекарственных средств укрепляет связь между физико-химическими свойствами конденсатов и их биологической или патологической ролью.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую исследовать состав конденсата и молекулярный обмен без использования внешних меток.
- Способствует снижению механистических рисков путем количественного определения коэффициентов распределения и скоростей обмена между фазами.
- Повышает достоверность прогнозов при выборе мишеней, раскрывая динамику и организацию конденсатов.
- Облегчает сортировку портфеля проектов за счет разграничения функциональных и патологических состояний конденсатов.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает валидированные количественные показатели структуры и гидратации конденсата для последующих анализов.
- Поддерживает стандартизацию анализа за счет получения воспроизводимых измерений без использования меток.
- Позволяет проводить скрининг модуляторов, влияющих на динамику конденсатов или фазовое поведение.
- Способствует повторному использованию платформы для различных биомолекулярных систем, проявляющих LLPS.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит физико-химические свойства конденсатов в соответствие с механизмами развития заболевания, если патология подтверждается LLPS.
- Обеспечивает преемственность от этапа поиска до доклинической валидации за счет отслеживания характеристик конденсатов в различных моделях.
- Поддерживает продвижение проекта с учетом рисков, предоставляя количественные механистические биомаркеры состояния конденсатов.
- Обеспечивает прогностическое снижение рисков для мишеней, вовлеченных в расстройства, связанные с фазовым разделением.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Эти методы ЯМР занимают определенное место в континууме открытий — от ранней проверки гипотез до идентификации ведущих соединений и доклинических исследований, что позволяет проводить надежную характеристику механизмов, управляемых конденсатами.
- Открытия в биологии: способствует проверке гипотез и уточнению путей посредством количественного определения молекулярного распределения и обмена.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты для разработки анализов и оценки соединений.
- Аналитика: предоставляет данные измерений диффузии, обмена и гидратации для сравнения условий и принятия обоснованных решений.
- Трансляционные исследования: связывает свойства конденсатов с механизмами заболеваний в случаях, когда задействован процесс LLPS.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую безмаркерную платформу ЯМР для различных систем конденсатов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Стандартизирует и масштабирует безметковый анализ конденсатов между группами НИОКР.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность использования капитала за счет раннего снижения рисков, связанных с биологическими механизмами.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение мишеней, значимых для процесса жидкостного фазового разделения (LLPS).
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области ЯМР-спектроскопии в растворах и биофизики фазового разделения.
- Необходим доступ к ЯМР-инструментам высокого поля и аналитической инфраструктуре.
- Рекомендуется межкомандная стандартизация подготовки образцов и анализа данных.
- Метод применим как к динамическим, так и к жестким системам конденсатов с использованием взаимодополняющих методов ЯМР.
- Применимо только к конденсатам, доступным для ЯМР-детектирования или мониторинга протонов воды, как описано в методике.
