Среднепроизводительная экстракция ДНК из колонки с использованием 24-колодных стеллажей

Наше исследование сосредоточено на 3D-печатных штативах для параллельной экстракции ДНК и РНК с использованием спиновых колонок, что позволяет объединить ручные и автоматизированные методы. Данная разработка устраняет ограничения трудоемких ручных методов с использованием спиновых колонок, обеспечивая одновременную обработку до 116 образцов ДНК или РНК. Для начала работы используйте 3D-принтер с технологией FDM и соплом диаметром 0,4 millimeter для печати штатива.

Используйте стандартную нить из полилактида (PLA), полиэтилентерефталат-гликоля (PETG) или акрилонитрилбутадиенстирола (ABS) со 100% заполнением. Установите высоту слоя 0.1 millimeter и включите сглаживание поверхности. Настройте параметры печати для обеспечения водонепроницаемости и механической стабильности.

Перед первым использованием проверьте стойки на водонепроницаемость. Для тестирования заполните напечатанный резервуар 70% этанолом. Центрифугируйте в течение постепенно увеличивающихся интервалов времени, чтобы подтвердить отсутствие утечек или структурных повреждений.

После успешного тестирования с помощью клея соедините компоненты базового резервуара вместе для создания герметичного блока. Инокулируйте трансформанты escherichia coli или E.Coli в 3–5 мл лизогенного бульона (среды LB), содержащего соответствующие антибиотики. Инкубируйте культуру в течение 12–16 часов при 37 °C с перемешиванием.

Центрифугируйте при 2000 G в течение 10 минут для осаждения клеток. Удалите супернатант. Добавьте 250 microliters буфера для ресуспендирования к осадку.

Полностью ресуспендируйте осадок путем вортексирования или пипетирования. Добавьте 250 µL лизирующего буфера. Осторожно перемешайте, перевернув пробирку четыре-шесть раз или покачав 24-луночный планшет.

Добавьте 350 µL нейтрализующего буфера и перемешайте. Образование белого осадка подтверждает успешную нейтрализацию. Добавьте лизирующий буфер в пробирку с порошком диоксида титана.

Добавьте суспензию в соотношении объема к массе 2:1. Добавьте 250 µL суспензии диоксида титана к лизату. Перемешайте, встряхнув пробирку.

Добавьте 350 µL нейтрализующего буфера и тщательно перемешайте. Центрифугируйте при 2000 G в течение 10 минут. Убедитесь, что клеточный осадок полностью выпал в присутствии диоксида титана, а супернатант стал полностью прозрачным.

При отсутствии диоксида титана обратите внимание на наличие остаточного осадка в супернатанте. Соберите супернатант, не затрагивая осадок, и перенесите его в колонку для связывания. Поместите колонки для связывания ДНК в слой держателя колонок штатива.

Установите крышки колонок в соответствующие пазы для их фиксации во время центрифугирования. Поместите колонки для осветления или фильтрации в слой фильтрующих колонок непосредственно над связывающими колонками. Перенесите подготовленный нейтрализованный лизат в фильтрующие колонки.

Поместите собранный штатив в ротор с качающимися стаканами. Центрифугируйте при 2000 G в течение одной минуты при комнатной температуре. После извлечения штатива из центрифуги снимите и утилизируйте слой фильтрующей колонки.

Слейте проскок из резервуара в контейнер для отходов. Поместите колонки для связывания обратно в штатив. Добавьте от 500 до 700 µL промывочного буфера в каждую колонку для связывания.

Центрифугируйте при 2000 G в течение одной минуты. Удалите фильтрат из резервуара и повторите стадию промывки, как было продемонстрировано ранее. Извлеките связывающие колонки из штатива и перенесите их в пробирки для сбора объемом два миллилитра.

Центрифугируйте при 10 000 G или выше в течение одной минуты, чтобы высушить мембрану. Перенесите колонки в чистые пробирки объемом 1,5 мл. Добавьте 50 µl элюирующего буфера или воды непосредственно на мембрану и инкубируйте колонки в течение одной минуты при комнатной температуре.

Центрифугируйте при 10,000 G или выше в течение одной минуты для элюции ДНК. Общий выход плазмид не показал значимых различий между традиционным методом и экстракцией с использованием конфигураций штатива. Подтверждение наличия плазмиды было сохранено с аналогичным распределением релаксированных, линеаризованных и суперскрученных форм.

Распределение красителя было ограничено областью сбора отходов непосредственно под заполненными колонками; видимого сигнала в соседних лунках или на кончиках соседних колонок обнаружено не было, что указывает на то, что конструкция штатива снижает вероятность разбрызгивания и переноса между колонками. Амплификация была обнаружена только в элюатах из тех колонок, в которые был добавлен ампликон. Данная частица позволяет исследователям получать высококачественную плазмидную ДНК для последующего использования, включая клонирование, секвенирование и ПЦР-анализ.

Наиболее важным аспектом при выполнении данного протокола является предотвращение перекрестного загрязнения путем использования герметичного, без переливов, напечатанного на 3D-принтере резервуара. Кроме того, после завершения этой процедуры данные штативы можно использовать для любого анализа по экстракции нуклеиновых кислот с использованием колонок.