Обнаружение старения с помощью отражённого света в жировой стромальной сосудистой фракции

Мы изучаем старение адипоцитов при различных жировых отложениях и метаболических состояниях, таких как ожирение и гиперинсулинемия. Традиционные SABG-анализы на базе Brightfield не позволяют мультиплексирования и очень субъективны. Наш новый протокол менее субъективен и позволяет мультиплексировать.

Для начала достаньте трубку, содержащую жировую ткань человека. Гомогенизировать 10 граммов жировой ткани и добавить их в трубку с 0,05% коллагенового фермента первого типа для получения примерно одного миллиона стромальных сосудистых фракционных клеток (SVF). Аликвот 500 000 ячеек в каждую 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку.

Добавьте в трубку один миллилитр 2% параформальдегида для фиксации клетки. Затем инкубировать на качалке при комнатной температуре 20 минут. Центрифугуйте при 600G на 10 минут и удалите супернатант.

Приготовьте раствор для окрашивания X-Gal с помощью набора для окрашивания бета-галактозидазы старения согласно инструкциям производителя. Добавьте один миллилитр раствора для окрашивания в три свежих тюбика. И скорректируйте pH до пяти, шести и восьми, используя один молярный раствор соляной кислоты или один молярный раствор гидроксида натрия.

Используйте калиброванный pH-метр для проверки pH. Добавьте раствор для окрашивания X-Gal с регулировкой pH в каждую из маркированных трубок, содержащих 500 000 клеток. Инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов без углекислого газа.

Центрифугуйте клетки при 600G в течение 10 минут. После удаления супернатанта промой клетки с помощью PBS. И снова центрифугировать при 600G в течение 10 минут.

После удаления супернатанта для идентификации эндотелиальных клеток внутри гетерогенного SVF инкубировать клетки с эндотелиально-специфическим CD31 или контролировать первичные антитела IgG при четырёх градусах Цельсия за ночь. Промыйте клетки три раза с 0,1% PBST в течение 10 минут при комнатной температуре на коротеле, чтобы удалить несвязанные первичные антитела. И центрифуг при 600G в течение 10 минут.

После отброса супернатанта инкубируют клетки с вторичным антителом в течение часа при комнатной температуре на рокере. Центрифугуйте при 600 г в течение 10 минут, чтобы удалить вторичный раствор для окрашивания антител. Промыйте клетки три раза с помощью PBST, а затем центрифугой, как было показано ранее.

Снова суспензировать клетки в антифейд-маунтанте. Пипетировать подвеску клетки на микроскопические стекли и затвердеть за ночь при комнатной температуре, чтобы обездвижить клетки. На следующий день добавьте 100 микролитров 100% глицерина.

Наденьте накладку сверху и запечатайте лаком для ногтей. Разместите подготовленное стекло на сцене конфокального микроскопа. В программном интерфейсе микроскопа выберите опцию Световой путь и настройте разделитель луча на T90R10.

Далее проверьте значения срезающих длин волны для вторичных дихроических зеркал (SDM) в настройках Зеркала. В меню «Детектор» нажмите на опцию «Выбор краски и детектора», чтобы назначить каналы и длины волн возбуждения. Затем установите процентные значения интенсивности лазера для каждого конкретного лазера в диапазоне от 10 до 15%. В меню Series, в разделе LSM, переключите опцию Z на On. Установите размер шага Z на оптимальный размер системы 0,74 микрометра.

Далее, в меню раздела Z, введите значение для входного поля старта и определите стек Z, основанный на сигнале мембраны, чтобы захватить полный объём ячеек. В панели Acquire введите имя файла и место сохранения файла в поле ввода LSM. И нажмите LSM Start, чтобы начать сбор изображений.

И сохраняйте файлы в нативном формате микроскопа OIR. После получения используйте стрелки навигации Z для проверки сигнала и распределения фокусов различных красителей по всему стеку Z. Загрузите сохранённый oir-файл в Image J.In всплывающем окне опций импорта биоформатов, нажмите Хорошо.

Нажмите на меню изображения, чтобы открыть файл. В выпадающем меню выберите Цвет, затем Разделить каналы, чтобы открыть разные каналы как отдельные окна. Далее отрегулируйте контраст яркости и оптимизируйте значения LUT с помощью опции «Корректировка» в меню «Изображение» для улучшенной визуализации изображения.

Используйте полосу прокрутки по оси Z внизу кадра, чтобы пройти оптические секции и проверить сотовые особенности по всему стеку. В меню «Изображение» выберите «Стек». Затем выберите функцию проекта Z для генерации суммарных проекций интенсивности трёхмерного конфокального изображения.

В диалоговом окне Z-проекции определите диапазоны начала и остановки срезов. Выберите тип проекции и нажмите Ок, чтобы получить итоговое 2D-композитное изображение. Далее перейдите в меню «Изображение».

Выберите опцию «Тип», чтобы настроить тип изображения на 16-битный. Затем сохраните и экспортируйте изображения в 16-битные TIF-файлы. Импортируйте сохранённые изображения в CellProfiler версии 4.2.8 для автоматической сегментации ячеек, количественной оценки интенсивности отражённого света для каждой ячейки и экспорта значений измерения интенсивности в таблицу.

В таблице определите порог позитивности бета-галактозидаз, связанной с старением, как сумму средней интенсивности отраженного света условия pH 8 плюс три стандартных отклонения. Классифицировать клетки с состоянием pH 6 как положительные бета-галактозидазы, связанные с старением, если их значения интенсивности превышают установленный порог. Окрашивание бета-галактозидаз, связанное с отражённым светом, в клетках SVF человека получило чёткие и воспроизводимые закономерности на трёх уровнях pH.

При pH 5 большинство клеток демонстрировали сильный сигнал благодаря высокой эндогенной активности ферментов. При стандартном значении pH 6 интенсивность и частота сигнала снижались, что позволило специфически идентифицировать клетки бета-галактозидазы, ассоциированные со старением. При pH 8 сигнал был минимальным, и это служило базой для определения порога позитивности.

Тестирование чувствительности показало, что изображение отражённого света превосходит Brightfield при всех условиях pH. При pH 5 отражённый свет демонстрировал сильные осадки X-Gal, тогда как в Брайтфилде были только самые крупные отложения. При pH 6 отражённый свет выявлял положительные клетки, которые были слишком слабы или рассеяны, чтобы их можно было увидеть в Брайтфилде.

При pH 8 визуализация с отражённым светом обнаружила минимальный сигнал, что соответствует низкой ферментативной активности, превосходя Brightfield в выявлении осадков X-Gal на промежуточных и низких уровнях активности. В целом, этот рабочий процесс визуализации отражённого света интегрирует одновременное обнаружение бета-галактозидазы, ассоциированных с pH-старением, и флуоресцентных маркеров, таких как CD31, что облегчает многофункциональную оценку старения при разрешении одной клетки в гетерогенных популяциях SVF. Этот протокол позволяет проводить чувствительные и количественные измерения активности SABG, одновременно учитывая как другие маркеры старения, так и другие клеточные маркеры.

Главная сложность, на мой взгляд, — это начальная настройка микроскопии. Но когда это оптимизируется, можно использовать одни и те же параметры приобретения в разных экспериментах. Будущие исследования могут объединить этот анализ с другими субклеточными маркерами, чтобы выяснить, как SABG взаимодействует с различными клетическими процессами.