Метаболическая маркировка зарождающегося транскриптома в раннем эмбриогенезе Xenopus

В этом исследовании мы изучаем, как активация зиготных генов и переходная регуляция происходят в раннем генезе эмбриона ксенопуса. Существующие методы испытывают трудности с обнаружением новых активированных зиготических транскриптов, выделяющих обильное количество материнских РНК. Этот протокол маркирует и обогащает зарождающиеся транскрипты.

Для начала поместите камеру микроинъекции под стереомикроскоп и добавьте в камеру один миллилитр раствора Ficoll. Получите эмбрионы Xenopus laevis, хранящиеся в 0,1X марках, модифицированных рингерах или растворе MMR. Используйте пластиковую пипетку для переноса 20 и более эмбрионов в центр камеры микроинъекций.

Подготовьте инъекционную иглу, обрезая тонкий кончик стеклянной иглы пинцетом. Поставьте иглу вертикально, наконечник вниз, и загрузите 0,5 микролитра 50 мМ 5-этинилуридина или 5 M EU, используя пипетку P2 с наконечником микрозагрузчика. Закрепите иглу на микроманипуляторе.

С помощью пипетки P10 нанесите 10 микролитров галоуглеродного масла на сценический микрометр, расположенный под стереомикроскопом. Для калибровки объёма нажмите педаль ножки микрофорсунки и введите каплю в галоуглеродное масло на микрометре. Регулируйте давление и время впрыска на микрофорсунке, пока диаметр капли не достигнет 0,27 миллиметра.

Держите эмбрион на одной клеточной стадии пинцетом и управляйте иглой с помощью микроманипулятора, чтобы ввести 10 нанолитров 50 мМ 5 EU. Перенесите введённые эмбрионы в новую стеклянную чашу с раствором Фиколла и инкубировать в течение одного часа. Удалите раствор Ficoll и добавьте раствор 0,1 XMMR. Визуально осматривайте эмбрионы в процессе развития и при необходимости удаляйте любые аномальные эмбрионы.

Переместить 10 эмбрионов на желаемой стадии развития в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра. Удалите остатки из пробирки, быстро заморозьте эмбрионы в жидком азоте и храните в морозильнике при минус 80 градусах Цельсия. Затем извлекайте полную РНК из эмбрионов и измеряйте её концентрацию с помощью коммерческих наборов.

Чтобы получить щелчок на 50 микролитров, смешайте указанные компоненты в микроцентрифугной трубке объемом 1,5 миллилитра. Инкубировать реакционную смесь на нутаторе при комнатной температуре в течение 30 минут. Теперь добавляйте гликоген, ацетат аммония и охлаждённый этанол в каждую смесь реакций.

Хорошо перемешивайте, пипетируя пять раз. Инкубация на ночь в морозильнике с минус 80 градусами Цельсия. После ночной инкубации центрифугуйте при 13 000 G в течение 20 минут при 4 градусах Цельсия, затем удалите супернатант, не нарушая гранулу.

Промой гранул дважды 700 микролитрами 75% этанола. После центрифугирования и выброса супернатанта высушите гранулу на воздухе при комнатной температуре в течение пяти-десяти минут и снова суспензируете гранулу в 10 микролитрах воды без РНаз. Введите пять микролитров магнитных шариков, покрытых стрептавидином, в новую трубку объёмом 1,5 миллилитра.

Добавьте девять микролитров буфера для стирки 2 в шарики и хорошо перемешайте. Поставьте трубку на магнитную стойку на две минуты. Снимите супернатант и повторите стирки ещё два раза.

Затем подвесьте шарики в пяти микролитрах буфера для стирки 2. Приготовьте мастер-смесь в микроцентрифуге объемом 1,5 микролитра. Добавьте 15 микролитров мастер-смеси в каждую пробирку с образцом РНК.

Поставьте трубку на нагревательный блок и инкубуйте при 69 градусах Цельсия в течение пяти минут. После этого поставьте трубку на лёд. Затем добавьте пять микролитров заранее промытых шариков в каждый образец РНК и инкубуйте на нутаторе при комнатной температуре в течение 30 минут.

Промывайте РНК-комплексы шариков пять раз с 50-микролитровым буфером для промывки 1, затем пятью промывами с 50-микролитровым буфером 2. Подвесьте бусины в пятимикролитровом буфере для промывки 2. Используйте шарики, содержащие зарождающиеся РНК ЕС, непосредственно для комплементарного дезоксирибонуклеинового кислотного синтеза и подготовки библиотеки.

Увеличение числа дифференциально активированных генов было обнаружено во время активации зиготного генома, когда зарождающийся транскриптом через шесть часов после оплодотворения сравнивался с транскриптом через пять часов после оплодотворения, при этом дальнейшие увеличения наблюдались через семь часов после оплодотворения, восемь часов после оплодотворения и девять часов после оплодотворения. Зиготные гены были обнаружены на более высоких уровнях и на более ранних этапах в зарождающихся данных РНК ЕС по сравнению с общими данными секвенирования РНК. Тщательная очистка метаболически маркированных зарождающихся РНК является самым важным фактором для обеспечения чувствительности и специфичности в этом протоколе.

Маркированные в ЕС зарождающиеся РНК, полученные по этому протоколу, могут дополнительно анализироваться биохимически in vitro. Такой подход позволяет в будущем изучать паттерны активации генома, специфическую экспрессию генов в тканях и регуляторные механизмы в виде разрешения отдельных клеток.