Стандартизированный протокол для индуцирования преждевременного старения, вызванного стрессом, в первичных меланоцитах человека с использованием трет-бутилгидропероксида

Наше исследование сосредоточено на изучении фенотипа старения меланоцитов и его вклада во внешнее старение кожи. Общепринятые модели старения используют фибробласты, что не позволяет учесть биологические особенности, специфичные для меланоцитов. В данном протоколе индуцируется окислительный стресс в первичных меланоцитах человека с помощью tBHP.

Для начала подготовьте необходимые реагенты. После размораживания меланоцитов и их восстановления в течение трех дней убедитесь, что в день посева клетки достигли 80–90% конфлюэнтности. Аспирируйте среду из флакона.

Дважды промойте клетки DPBS. Добавьте два миллилитра раствора трипсина-ЭДТА для открепления клеток. Поместите флакон в инкубатор на пять минут при 37 °C и 5% carbon dioxide.

Осторожно постучите по колбе. Затем под микроскопом осмотрите клетки, чтобы подтвердить их полное открепление. Добавьте ингибитор трипсина в объеме, в 1,5 раза превышающем объем среды, чтобы остановить реакцию.

Перенесите суспензию клеток в коническую пробирку объемом 15 мл. Разбавьте суспензию DPBS до конечного объема 10 мл. Центрифугируйте суспензию клеток при относительной центрифужной силе 100-g в течение пяти минут.

Отоберите супернатант и ресуспендируйте осадок клеток в среде до нужного объема. Для планшетов, которые будут подвергнуты воздействию трет-бутилгидропероксида (tBHP), высейте по 600 000 клеток на чашку диаметром 10 сантиметров. Для контрольных планшетов высейте по 400 000 клеток на планшет.

Приготовьте рабочий раствор tBHP с концентрацией 10 мМ из основного запаса, используя DPBS или среду. Добавьте к клеткам 100 мкМ tBHP на один час для каждой обработки. Аккуратно перемещайте планшет вперед-назад, чтобы равномерно распределить tBHP по всей среде.

Поместите клетки в инкубатор ровно на один час при 37 °C с 5% углекислого газа. Аспирируйте среду, чтобы прекратить воздействие tBHP. Дважды промойте планшеты предварительно нагретым до 37 °C DPBS.

Добавьте в лунки соответствующий объем свежей среды. Поместите планшеты в инкубатор и дайте клеткам восстановиться в течение как минимум четырех часов перед следующим этапом обработки. Повторите процедуру обработки позже в тот же день для проведения второго этапа.

Продолжайте режим обработки до четвертого дня, затем поддерживайте клетки в культуре до девятого дня для оценки маркеров старения. Подсчитайте количество клеток, подвергнутых воздействию tBHP, и контрольных клеток. Пересейте их с той же начальной плотностью или, если с планшетов с обработанными tBHP клетками получено менее 600, 000 клеток, пересейте все собранные клетки.

Подсчитайте количество клеток на четвертый, девятый и пятнадцатый дни культивирования. На девятый день дважды промойте клетки раствором PBS. Зафиксируйте клетки, используя 2% формальдегид и 0,4% глутаральдегид.

Дважды промойте фиксированные клетки раствором PBS. Инкубируйте фиксированные клетки в окрашивающем растворе при pH 6. Накройте планшет для защиты от света, затем инкубируйте их в течение 18 часов при 37 °C в отсутствие углекислого газа.

Дважды промойте клетки PBS. С помощью световой микроскопии снимите изображения и подсчитайте количество окрашенных в синий цвет клеток. Разделите полученное число на общее количество клеток в том же поле зрения.

Представьте результаты в виде процента положительных клеток. После индукции окислительного стресса обработка tBHP значительно снизила пролиферацию меланоцитов по сравнению с контрольной группой. К девятому дню обработанные клетки достигли лишь 1,4 совокупных удвоений популяции (cPDL), тогда как в контроле этот показатель составил 3,1 cPDL.

К 15-му дню количество удвоений (cPDL) обработанных клеток вышло на плато на уровне 1,9, в то время как контрольные клетки достигли 5,1 cPDL. Меланоциты, обработанные tBHP, демонстрировали увеличение площади поверхности клеток по сравнению с контролем во всех измеренных временных точках; увеличение продолжалось до 15-го дня, что соответствует увеличенной и уплощенной морфологии сенесцентных клеток. В меланоцитах, обработанных tBHP, наблюдалось повышение активности ассоциированной со старением бета-галактозидазы (SA-бета-галактозидазы): доля положительных клеток составила 32% по сравнению с 3% в контрольной группе.

Рост активности SA-бета-галактозидазы соответствовал фенотипу старения. Иммунофлуоресцентный анализ показал повышенный уровень gamma-H2AX в меланоцитах, обработанных tBHP, по сравнению с контролем. Обработанные клетки демонстрировали более сильный сигнал gamma-H2AX, чем контрольные.

Анализ методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени продемонстрировал повышенную экспрессию факторов секреторного фенотипа, ассоциированного со старением, при этом наибольший рост наблюдался для интерлейкина-8. В то время как интерлейкин-6 и матриксная металлопротеиназа-1 показали умеренное повышение. Вестерн-блот-анализ подтвердил индукцию старения.

Уровень ламина B1 был значительно снижен в меланоцитах, обработанных tBHP, по сравнению с контрольной группой. Уровни фосфорилированного белка ретинобластомы в меланоцитах, обработанных tBHP, были снижены по сравнению с контролем. Обработка tBHP привела к увеличению транскрипционной экспрессии p16 и p21 в меланоцитах.

Данная модель позволяет исследователям изучить, как сенесцентные меланоциты влияют на пигментацию и взаимодействуют с окружающими клетками посредством воспалительных факторов SASP. Основная сложность данного протокола заключается в точном соблюдении временных интервалов. tBHP необходимо применять дважды в день с интервалом не менее четырех часов.

Следуя данному протоколу, старение можно охарактеризовать с помощью окрашивания на ассоциированную со старением бета-галактозидазу, иммунофлуоресценции, RT-qPCR и вестерн-блоттинга общепризнанных маркеров старения.