Недорогая альтернатива для оценки социальных предпочтений у данио-рерио (Danio rerio) с помощью трёхкамерного открытого аквариума задачи свободного плавания

Данный протокол валидирует недорогой и открытый 3-камерный тест в открытом аквариуме для исследования социального предпочтения у zebrafish. Этот протокол может быть использован для различных видов и позволяет студентам-исследователям изучать социальное предпочтение при минимальных ресурсах. Для начала подготовьте установку с открытым аквариумом, состоящую из центральной экспериментальной камеры и двух боковых камер со стимулами.

Установите систему подсветки. Используйте непрозрачные разделители и поляризационные фильтры для оптимизации визуальной изоляции и видеоконтраста. С помощью опорной рамы установите и выровняйте камеры перед камерами образцов.

Задвиньте плотные шторы и обеспечьте стабильные условия содержания до начала эксперимента. Загрузите программу Open Broadcaster Software и установите ее на локальный компьютер под управлением Windows. После запуска программного обеспечения запустите мастер автоматической настройки для оптимизации параметров в соответствии с конкретными задачами записи, аппаратными ресурсами и сетевыми условиями.

Перед настройкой камеры проверьте основные параметры. Установите базовое разрешение холста в соответствии с разрешением дисплея и задайте соответствующее масштабированное разрешение вывода. Затем создайте сцену, щелкнув правой кнопкой мыши в окне сцен и выбрав «Добавить сцену».

Присвойте сцене имя и используйте его для определения макета потока. Добавьте новый источник и выберите «Устройство захвата видео» (Video Capture Device), чтобы добавить веб-камеру. Присвойте каждой камере уникальное имя, например, «Центральная камера» (Camera Center), и повторите этот процесс для дополнительной камеры.

Расположите и измените размер источников в окне предварительного просмотра. Убедитесь, что камера указана в списке источников. Чтобы переместить вид с камеры в центр холста, нажмите control + D. Чтобы вписать изображение в экран, нажмите control + F, или растяните его, нажав control + S. Обрежьте источник, удерживая клавишу alt и перетаскивая ограничивающую рамку.

Затем дважды щелкните по выбранной камере и нажмите «Configure Video». Отрегулируйте яркость и контрастность видео в меню свойств. Заполните все три камеры водой из накопительных баков и отрегулируйте температуру воды перед помещением рыб.

Убедитесь, что непрозрачные перегородки между камерами установлены на протяжении всего периода акклиматизации. Перенесите одну взрослую особь Danio rerio в центральную камеру и дайте ей акклиматизироваться в течение не менее одного часа. Поместите искусственные социальные стимулы в левую боковую камеру стимуляции.

Затем перенесите небольшую группу из четырех рыб, состоящую из двух самцов и двух самок схожего размера, возраста и степени знакомства, в правую стимулирующую камеру. Во время акклиматизации обеспечьте все камеры с живыми животными погружным нагревателем, установленным на 26 °C, аэрационным камнем, подключенным к аквариумному воздушному насосу, и крышкой для поддержания стабильных условий содержания. Перед началом экспериментальной сессии извлеките нагреватели и аэрационные камни.

Включите одну камеру, направленную на центральный резервуар. Запустите программное обеспечение и растяните окно просмотра центральной камеры на весь экран, перетаскивая углы видео. Затем в панели управления выберите Start Recording.

Немедленно удалите непрозрачные барьеры. Через 10 минут завершите сеанс, выбрав «Stop Recording» в панели управления. Для доступа к записанным сеансам выберите «File» в верхнем левом меню, а затем «Show Recordings» в выпадающем списке.

Загрузите от четырех до пяти видео в приложение для анализа движений, например DeepLabCut, и извлеките по 20–30 кадров из каждого видео. Определите как минимум три основные точки отслеживания, такие как голова, хвост и туловище. Обучите нейронную сеть отслеживать эти точки на кадрах.

Для обучения модели используйте нейронную сеть на базе ResNet-101. Определите количество итераций, необходимых для завершения обучения. Затем разверните полностью обученную модель DeepLabCut на оставшихся экспериментальных видео и извлеките позиционные данные для каждого испытания в соответствии с руководством пользователя.

Затем с помощью программного обеспечения для кодирования, например Python, определите и проанализируйте перемещения по трем вертикальным зонам арены равной ширины для количественной оценки предпочтений. Измеряйте время пребывания в каждой зоне, используя как минимум две точки тела внутри определенной зоны, чтобы снизить уровень шума при трекинге. Рассчитайте общее время в каждой зоне, разделив общее количество кадров в данной зоне на общее количество кадров.

Используйте то же программное обеспечение для анализа поведения, чтобы определить и измерить время пребывания в неподвижном состоянии, например, время замирания. Установите порог движения от 2 до 5 пикселей за кадр при минимальном количестве последовательных кадров, равном 15 кадрам. В завершение соберите и экспортируйте результаты измерений для статистического анализа и визуализации.

Испытуемые проводили значительно больше времени за сессию в правой зоне, ближайшей к живой стае, чем в средней зоне или в левой зоне, ближайшей к искусственному мобильному стимулу. Разница во времени пребывания между средней зоной и левой зоной была статистически незначимой. Испытуемые проводили значительно меньше времени в неподвижном состоянии в средней зоне, чем в правой зоне, ближайшей к живой стае, или в левой зоне, ближайшей к мобильному стимулу.

Данный протокол может быть использован исследователями для изучения склонности zebrafish к визуальному взаимодействию с двумя различными социальными стимулами и определения того, какой стимул является предпочтительным. Исследователи могут использовать разные виды или конфигурации стимулов, а также изучать другие реакции, такие как резкие рывки или хаотичное плавание. Система представляет собой платформу для изучения трансляционных моделей социального функционирования и может быть применена для исследования фармакологических и средовых манипуляций.